【国家标准(GB)】 桑蚕微粒子病病原鉴定方法

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中华人民共和国国家标准
GB/T20395—2006
桑蚕微粒子病病原鉴定方法
Identification of the pathogen of pebrine for silkworm(Bombyxmoril.)
070117000051
2006-05-26发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2006-12-01实施
中华人民共和
国家标
桑垂微粒子病病原鉴定方法
GB/T 20303—2006
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GB/T20395--2006
桑蚕微粒子病是我国进境动物检疫危险性病害，为防止该病随桑蚕革进境而传人我国，在进境动物检疫时需正确掌握桑蚕微粒子病原孢子的检疫和鉴定方法本标准在制定过程中，总结了多年柔蚕茧检疫的实践经验，根据桑蚕微粒子孢子的形态学特征和遇溶解的化学特性，确定了检疫和鉴定桑蚕微粒子病原孢子的各项技术要求。本标准的附录A是规范性附录，
本标推由国家标准化管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标推主要起草人：吴希帮、边玉民、李广华、王宝忠。本标推是首次发布的国家标准。1范围
桑蚕微粒子病病原鉴定方法
本标准规定厂桑蚕中微粒子病原孢子的检疫和竖定方法。本标准适用于桑蚕茧中感染微粒子病的检疫和鉴定。2规范性引用文件
GB/T20395—2006
下列文中的系款通过本标的引用而成为本标推的条款。凡是注日期的用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB6682—1992分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088—2000出人境动物检疫来样3原理
微粒子病的病原体微孢子虫是一种原生动物，分类地位属于原生动物门，单丝孢子虫亚门，微孢子虫纲,微孢子虫日，单丝孢子虫亚日,微孢子虫科微徽孢子虫属。它的生活周期中有孢子,孢子发芽、裂殖体、孢了形成期。
孢子罩卵形或长卵圆形，大小为（3.6μm~3.8μm）×（2.0um～2.3μm），单细胞结构，见附录A。其大小在定范围内是相对稳定的，但由于寄主发育阶段及寄牛部位不同而有差异。在显微镜下呈淡蓝色，折光性强，密度1.30~1.35，遇酸溶解。孢子进人柔蚕消化道后，受消化液的作用而发芽，弹出极丝，放出孢原质，进一步形成裂殖体，裂殖体常以二分裂法增殖，进入孢子形成阶段形成孢子。孢子是微粒子原虫的休眠体。由孢子侵人蚕体至新孢子形成，一般需要4d～8d微粒子病的传染源包括患病的蚕，、蛾的尸户体排泄物（如：蚕粪、熟蚕尿、蛾尿）脱离物（如：蜕皮壳，蛹壳、鳞毛等）。其传播途径主要是食入传染和胚种传染。被微粒子孢子感染的病蚕上族结茧后·随柔蚕茧进境而传播。在进境柔蚕苗检疫工作中，该病原孢子的形态特征，特性是本标推鉴定方法的依据。
4试剂
4. 1浓盐酸(HCI)。
4.220%的氢氧化钠（Va)H)。
4.3分析用水接GB/T6682—1992规定执行。5仪器、设备
5.1相差显微镜。
5.2生化培养箱（温控范围10℃～50℃），5.3冰箱。
5.4天平（感量：0.1g)。
5.5离心机。
5. 6 离心管。
5.7载玻片。
GB/T20395—2006
5.8盖玻片。
5.9量简。
5.10研钵。
5.11手术剪、镊子。
5.12烧杯。
5.13培养皿。
5.14移液管。
5.15采样袋。
5.16医用纱布。
6抽样方法
6.1抽查
6.1.1抽查方法
抽查在现场进行，抽查前应对待检柔蚕董的有关单证、产地，包装、数量等进行核实，用随机的方法进行抽查。首先抽查蚕虽是查烘十，剪开蚕茧后，其内容物手捏成粉末状为烘干董，而手捏发涩，甚至有液体流出者为半干革，江苹内一切病源微生物都已被灭活，半干堇内感染的粒于泡子未被火活，具有传染性和致病性。
6.1.2抽查件数
按表1所列比例抽查
动物产品种类
6.2采样
取样、采样（GB/T18088——2000）批量货物总数/件
101250
251~10000
6.2.1采样结合抽查进行按表1所列比例采样。6.2.2采样过程中应选最半下茧（包括农药杀黄检验。
抽检货物的采样数/件
（最多10）
每份样品的量
10粒蚕黄
日晒去湿董）、鲜革及螺作为样品，带回实验室6.3样品的保存
现场采样后，将样品混匀后平均分成两份，一份作为检样，一份作为保存样品。检样装袋后置于0℃～4℃冰箱中保存，以备检验，保存样品装袋经密封后，置于18℃保存个月。如发现桑蚕微粒子病，该样品至少需保存6个月，以备复验、谈判和伸裁。7显微镜检查
7.1直接检查法
从检样中取出、蛾剖开后，用镊子沾取体内不同部位少许组织分别涂于不同载玻片上，加人适量无菌水混匀，盖上盖玻片镜检（600倍以上）有无微粒子孢子。若检样中脂肪球数量过多影响镜检时，应加入适量20%氢氙化钠充分混勾作用10min后再进行检查，直接判定。如果镜检该批检样末检出微粒子病原孢子时，需收集检样用7.2法离心浓缩后再进一步检查。7.2离心浓缩法
经7.1法未检出微粒子病原孢子的检样收集后，将蛹及其他残留组织、蛾于研钵中加2倍～3倍20%氢氧化钠溶液充分磨碎并作用10min后，加人适量无菌水充分搅拌，用两层医用纱布过滤除去残2
GB/T20395—2006
渣.将滤液倒人离心管,以4 000 r/min离心10 min～20 min,弃去上清液,加适景无菌水于离心管充分搅拌沉淀物再离心弃去上清液，取沉淀物置载玻片上，加人适量无菌水混勾，盖「盖玻片镜检（600倍以上)有无微粒子孢子，每个检样至少检查10个玻片。7.3酸溶解法
镜检时有时会遇到畸形的微粒子孢子（多半是梨形或长形孢子），往往易与真菌孢子相混淆，必要时可进行酸溶解处理,加以鉴别诊断。取捡出样2滴,分别滴于载玻片两端，自然干燥后在其中一点加一滴浓盐酸（密度 1.15),另一点作对照,在30℃生化培养箱中放置 10 min～20 min 后,然后盖上盖玻片镜检（600倍以上）。如果试样已干，可加无菌水一滴。经过酸处理的检样，微粒子溶解消失，而真菌孢子仍保持原状。
8结果判定
8.1直接检查法及离心浓缩法
当镜检发现孢子呈卵形或长卵圆形，大小为（3.6um~3.8μm）×（2.0μm2.3m）.呈淡蓝色，折光性强，判定其为微粒子孢子（见附录A)。8.2酸溶解法
加酸作用后·被溶解的炮子判定其为粒子孢子。GB/T20395—2006
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附录A
（规范性附录）
微粒子孢子图
微粒子孢子图（放大600倍）
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