【国家标准(GB)】 三系杂交水稻及亲本 真实性和品种纯度鉴定 DNA分析方法

ICS 65. 020. 20
中华人民共和国国家标准
GB/T20396--2006
三系杂交水稻及亲本
真实性和品种纯度鉴定
DNA分析方法
Identification of genuineness and varielal purity of three-line hybrid riceand its parents--DNA analysis methodl2006-05-25发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2006-11-01实施
GB/T 20396—2006
规范性引用文件
术语和定义
试剂和溶液
实验程序
结果报告
附录A（规范拦附录）
附录3（规范性附录）
附录（（规范性附录）
附录（规范性附录）
附录E（资料性附录）
附录F（资料性阴录）
附录G（资料性附录）
愛考文献
水稻其因红DNA的提取
DNA的纯化及定最
变性骤丙烯酰胺凝胶电泳
琼脂糖凝胶电漆
用于杂交水稻鉴定的SSR标记
用于杂交水稻不育、保持和恢复特征基阅检测的分子标记相关统计参数及计算
GB/T 20396—2006
木标准的附录A、渐录B3.附录C、附录D是规泄性附录，附录E、随录F、附景G是资将性附录。本标推出国家质量监督检验检疫总局提出。本标准出全国农作物种子标准化技术委量会归口，本标准起单单位：安徽省农业科学院水研究所、安徽国家农业标准化与监测中心、安徽省种子管班总站、合肥丰乐称业股份有限公司。木标准主要起堂人：杨剑波、赵伟、陈萍、李、注秀峰、宋十顺、宣云、张工胜、品成新、孔令传、盛游平、王春生、问太和。
本标准为首次发布。
GR/T 203962006
在杂交水稻品种审定、生产，制种和销岱等过程小，往往需要对品种的真实性和杂交稻种了纯度进行鉴定，常规的方法为种挡鉴定、生化检测等，本标准提供的工N八分析方法具有证确度高、时叫短、受环境影响小等优点。木标准的制定和实施将对我国杂交水稻称子质量控制起到积极作用。随着杂交水稻新品系、新组合、新类型的选育及LNA分新理论和技术的不断进步，本标准尚需不时进行修订
1范围
三系杂变水稻及亲本
真实性和品种纯度鉴定
DNA分析方法
本标准规定了用DNA分析技术进行GB/T 20396—2006
系蒙交水释及其案苯翼实性和品种纰度鉴定的方法。本标准适用于三系杂交水及其本真实性和战2规范性引用文件
下列文件中的条款通过举标催纳引用醇的修改单（不包括勘误的膚穿）感计版均是否可使用这些文件的新版苯。凡是农物子检验规程
GH/ 3543.1
囊作物种子检验规程
GB/T 3543, 2
GB/F 3543. 4
G/T 3543. 5
GB/T 6682
3 术语和定义
携物种子检验规程
种子检验规荐
斯的市
嘉验室用水规格和试
GB/T3543.2、GB/T543.5中确文嗮3. 1
度的鉴定。
是注期的就用文件，其随后所有根据不标准送成协议的务方研究本适用手本标锥。
件，其最
本标准
聚合酶链式反应中erasechhinion.PCR一种利用酶促反应绿特选DNA片段用一种耐高温的LNA聚合织需非常楼DNA为模板合成上亿个接擎
以短核计酸序刻作为引物，并使体外护增的技术，该趣
薄常在纳克级范耳内DNA品，鑫短时间内以样品引物priner
一条互补结合在模板DNA键的短的单链，缇供3'OH端作DNA容成的起点，延伸合成模板DNA的互补链。
SS 标记simple seguence repeat,SSR..
由几个核酸般为2个个）为画复单元的长达几十至几百个核苷酸的串联重复序列：出于其本单元重复次数的不同，而形成SSR率位的多态性：根据SSR座位两侧保守的单拷贝序列设订一剂特异引物来扩增SSR序列，即可揭示其多态性。3.4
三系杂交水稻three-lime hsybrid rice包不官系、保持系和恢复系，用个育系作持本与其同型保持系杂交繁殖不行系独了用不行系作母本与恢复系杂交牛产杂交稻种子1
GB/T 20396—2006
等位基因频率allelefreqneincy在·个倍体的某特定基因座上某一个等位基因占该基芮座上等位基因总数的比率。是群体遗传结构的-…个最甚本的尺度，该基因虑上所有等位基困的频率之利为1。3.6
多态性信息含量polymorphisminfornalioncontents，Pic评价一个多添性基因座使用价值的一个量化概念，出该基因座的等位基热效、等位基因频率分布两个因索次定，标记基因座的等位基因数越多、各等位片段的频率题均勾，多态性信息食量（PIC)踏大。4原理
品种的不同木质上是盅于其遗传物质INA核苷酸序列不同所致。众多的研究表明，水貉基因组中大量存在著：类简单连重复序列，其特点为以2个6个核甘酸为重复单位，头尼相连重复儿十次至数百次，这美序列称为微卫星DNA。微卫息DNA重复单位的事复次数会出现个同，在不尚然因型间同一基因座位的微卫星I小A往往表现为长度等的差异，真有十富的多态性，根据微星两端的单拷贝序列设计特异引物，利用HCR技术扩增每个位点的徽卫星DNA序列，通过电泳分析微卫虽DNA多态性，达到区别不同水稻品种（组合)的目的。懒卫星标记逼常具有共显性的特点，F杂交种了具有双亲等位基因的互补帮型。鉴于不育系和其同型保持系遗传肯景基本致，只在不育基闪、保持基因等特征基因上存在差异，据此特征基因选择DNA分子标记进行分析，从而实现有效的这别与鉴定。上述两者的结合，构成了本标准所指的杂交水稻及其亲本真实和品种纯度鉴定DNA分折法5仪器
5.1PCR扩增仪。
5.2高速冷冻离心机：最离心片20000g5.3TONA定量仪或紫外分光光度计：波长260nm及280ritmc5.4电冰仪：最高电序2000V,最大功率100W。5.5垂直测序电泳增及配套的潴胶附件。5.6水平电泳槽及配套的灌胶附件。5.7微量移液器；规格分别为10μL.20μl.、10CμL、290u1000l.连续可调。5.8低温冰箱：最低温度一20℃。5.9避胶战像系统或紫外透射仪。高岸灭菌锅：120℃+2℃
天平：分度值0.01g
植温水浴锅:漏葵精确度二1，
5.13床，
6试剂和溶液
除刃有说明外，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和（B/T6682规急的-…-级水。6.1试剂
6. 1. 1 异两醇。
6.1.2琼脂糖。
6.1.3N,N,N',N-四甲基乙二胺(TEMED)6. 1.4 液氮。
6.1.5四种脱氧核苷酸(dATP、cGTP、lCTP、dTTP),缩路为dNTP6. 1. 6 Tαy DNA 聚合嗨。
6.1.7DNA标准分量标记：
6.1.8SSR引物，引物列参见附录F6.1.9特征基因引物。引物底列参见附录G6.2溶液
6.2.1 乙醇
体积分数为70%，
6.2.2三氯甲烷十异戊醇→乙醇混合液V氯甲烷）+V异戊醇）-V乙醇)=80·4-+1。6.2.3INA提取液
GB/T20396—2006
100nol/LTris-HC(pH8.0）、2mnol/LEDTA（pll8.0)，00mmol/LNaCl质量浓度为1.5头的SrS。1.05k/em高压蒸汽灭菌15min,4C购存，用前颜热至60℃，便繁状沉淀完全溶解。6.2.410×PCR缓冲液
500mmol/LK(l,15mrnol/LMgCla，100nnl/ITris-Hcl(pH8.3，案温下）质量浓度为0.01%的明胶。1.c5kg/crn2高压蒸汽灭菌15min，20℃贮存，6.2. 55 × Tris-硼酸电泳缓冲液(5×RBE)450mmol//l.Tris-酬酸、10mmol/l.F)TA（pH8.0）。1.05kg/cm高压蒸汽火菌15min,4℃贮存，
6.2.650×lris-艺噬电泳缓冲液(50×TAE）2mol/1Tris-乙骏.50mrnol/1.E)TA(pH8.0），1.05kg/en高压蒸汽次菌1Emin,4℃忙存6.2.7澳化乙锭（EB)购液
10mg/mL溴化乙锭（E1）。
往：滨化乙锭为强诱变剂,不得直接接触皮肤，6.2.8加样缓冲液 A
质量浓度为80%的米离子甲跳胺、1Cmmnl/T.FT)TA、1Ing/mI溴蔬，111g/rL用苯鼠FF。6.2.9加样缓冲液B
2.5 mg/m 滨酚蔬、质昼浓度为40%的蔗糖6.2.10银染固定液
体积分数为10%的冰乙酸
6. 2. 11染色液
1g/LAgNO,1.5ml/1,甲醛。即用即配。6.2. 12显影液
30g/LNa，C.、1.5mT./T.中醛、2mg/L流代梳酸钠，即用即配。6.2.1310%过硫酸铵溶液
质量浓度为10次的过硫酸铵。4C，保行期7天。6.2.146%变性聚丙烯胺溶滴（交联度5%）57g/L丙烯酰胺、3/1.甲叉双丙烯酰胺、7mnl/1.。37℃充分溶解后，4℃静置保存，注：内烯酰胺民神丝性，应注查防护，7实验程序
7.1样品制备
7.1.1受检样品的拆样分样和保存，按GB/T3543.2的规定热行7.1.2试样的数量及询然值参照GB/T3543.5中的规定执行。检测时应以受检样品所标注品种的3
GB/I 20396—2006
标准种子作对照，标谁对照的真实性应准确无误，如受检样品为杂交种应将其双亲的标准种子也设为对照,
7.2样品 刀NA的握取
7.2.1材料
可取独子提圾DAA，钳可培养幼或从模取时片提取DNA。7. 2.2 种子 NA 的提取
敢单粒种了，剥宏颖尧和种皮，碾压使之破碎，移人2.0mI.离心管中，而人氮，用玻摔充分研磨牟粉米状。按附录A规定的方法捉取INA。7.2.3叶片办A的提取
按GB/T3543.4规定的忘崧培养幼尚，或从值株，单称取叶片约100mg，罩于2.0mL离心管中，加羧氮用棒充分研磨案粉末状，按附余A赢是的法提最DN7.3样品DA浓度和质量钓检测
7.3.1DNA浓度的测定Www.bzxZ.net
取DNA浒液培释至40
用本标准提供方送健取的DN
时董新提取。
般不假
7. 3. 2 DNA 质量的检测
应尚时使新下達)和h)两科进行
测定DNA家度
01g/，若港度过低成分析原因，必要质量的若检测结不合 ：)或 h)的要求，则DNA不可使症童新提取DNA
7%的琼脂糖凝磨进行电泳检测，a）取NA，按隔录C
鸟泳30到痒右，紫外光下观察，应在点样孔附近呈现一致密完带。蒜无带出现，早弥散状，则表阴DNA已，不可采用，
b）按方法稀释DNA溶定DD和吸光OD值.计算O2u/OD2sn的值。该比位应为爽。8左右。否则采用
7、4PCR扩增发应
7.4.1反应体素
25 μl.反应保积家盒0.2 mm
物;0.04U/ml.TaN聚合海
7.4.2反应程序
鑫杂魔
种dNTP温合物
甜录B规定的意法纳化后重新检测或不了mol/正商意物：0.2m01/L反间号A
复PCR缓冲液
推荐的退火温度设定）605，72%905.循环95C变性5min后g60s
35次，72C延伸6min，4c爆存待测m7.4.3对照设置
PCR扩增时，应设置标准对照和空自对题：拯准对照议标种子LNA为模板，空自对照以去离子水代替DNA，具他与样品反应体系、反应程序相同。7.5电涿检测
对于SSR标记，应按渐录)中规定的力法，采用变性聚丙烯胺凝胶电泳逊行检测；对丁特征基因分子标记，应按附录（中规定的方法，采用琼脂糖凝腔电泳进行检测。8鉴定
8.1将受检栏品的电泳谱带与标准对照的电泳谱带比较，根据谱带的-一致性，鉴定受检样品的真实性和品种纯度
8.2鉴定时，根据附录上中推荐的SSR标记，先选择12个PIC值较高、位于不同染色体上的SSR位GB/T 20396-2006
点进行分析，灌有2个及2个以上位点与标准对照不致，则判定该粒种子（幼、株）为异品种：若12个位点均与标准对照相同,测划定该粒种子(幼由、榛)为相同品种;猪有 1个 SSR位点与标准对照不致，则再选用12个SSR位点进行分析。若在新选用的12个SSR位点上又有1个及1个以.上位点与标准对照不一致，则判定其为异品种，若新选用的12个SSR位点均与标准对照相向，则判定其为相同品种
在进行SSR分析的同时，应从附录F中选择与受检样品相对应的特征基因标记逊行分析。杂交种亲本(不育系，保持系与恢复系)应具有相应基因的特征带型。杂交种子应同时具有相应不存基因和恢复基因的持征带型
8.3品种纯度（P)的数值以义表泵接载(1)计算：s
式巾：
供检种手料
判定考乐品神的种子
9结果报告
按GB/T3
无您！的规定热
Ney100
G/r 20396--2006
附录A
（鹅范性附录）
水稻基因组INA的提职
.1在处理好的诚样中，期600l.1>NA提取液，60℃水浴1h,隔15min频衡混勾一次。A.2加人等体积兰氯甲烷十异戊醇十乙,轻缓混勾,室温静置」h。A312000g，4\C.离心15min，将上清液转移至另·只1.5ml.离心管中，加等体积异内醇混匀，室温置30rhin.
A.412000g，4℃，离心15min，弃上清液A.5加200L体积分数为70%乙醇洗涤沉淀：离心10min（条件间第.4章）.弃去乙醇；重复洗涤次。
A,6风下残余艺醇。
A.7将沉凝溶于50l去离子灭菌水甲。附录既
（规范性附录）
DNA的纯化及定量
距、1RNA的去除
在50uL.DNA样品中，加人2ul.RNA酶（10mg/mL)，55水浴保溢12h，转入第B.2章米除RVA酶等蛋门质
.2蛋自质的去除
.2.1加人等体积的重蒸饱和酚，缓慢颠倒离心管，抽提20mi1，离心1031iw（12000g），将上清移系新的离心管中，
B.2.2圳人与上清等体积的三氯甲烷+异戊醇+乙醇，缓慢颠倒混匀10min.离心10min(12000g），将！清移至新的离心管中
B. 2. 3重复 B. 2. 2 —次。
B.2.4加入二倍体积的冰冷Z醇，1/10体积的3mo/I.NaAc：在一20℃冰箱中放置20 min，离心10min（12000g），收策DNA沉淀，奔上清，呢.2.5加人1mL体积分数为70收的乙醇，离心5min（12000g），干残留之醇弱.2. 6重复 B.2. 5·-次,风T残留乙B.2.7溶丁去离了水中
E. 3前NA 的定量
取DN八样品2，加去离子水398ml，放入比色网，用紫外分光光度仪，记录260nm和280nm的OD值，O2/OD%：的值在1.8左有，表明DNA纯虚较高。DNA的浓度按式（B.1)计算：c -- 50 X ODa X S
武中：
C…TNA的浓度，单位为纳克每微所（ng/uL)S——稀释数
..-(B. 1 )
巴.1凝胶制备
附景C
（规范性附录）
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
GB/T 20396--2006
C.1.1取清洗干的长、短玻璃板，用去离子水冲洗后晾于，用喷射洗喷无水乙婷，用吸水纸将平板擦干。
C1.2、取经过反碳化处理的长玻璃板（平板）和经过础化处现的短玻璃板（印板），按电泳槽使用手册用0.4tnm均厚的垫片组装凝胶皎膜求层，注意垫片与坡板的边、底压紧对齐。C.1.3在50m.6%变性聚闪烯酰胺溶液中人250μl.质量涨度为10%的过硫酸胺溶液，50LTEMED，充分混勾后，文即溉液，C.1.4用注射器小心吸出丙烯酰胺溶液，避免吸入气泡，让短平板朝1·关使凝胶半板夹层与桌面成25°负沿着平板的~边慢慢将内烯酰胺熔液推人两片平板之间，期间可调整角度让胶液慢慢流人来层的·边，不在夹层中留有气池，C.1.5当游液达到短平板的项部时，放下胶模夹层系其顶部边缘离操作台平面仍有5C左右，其下垫一物件以使之保持较低的角度，将0.4mn厚的鱼齿样品梳的平齐侧插人胶液中，至短乎板下约2m～3II，操作须→分小心以避免生气泡：用一个书本装订夹将乎板之间的样品梳夹紧，以避免在梳子与平板间形或凝胶剧块。加一层过最的闪烯酰胺溶液全梳子，保证其被完全覆盖。℃.1.6待胶凝固后，用刀片除去样品梳陶函的过量聚内烯酰胺凝胶。用水清洗乎板丧画溢出的尿素和丙烯酰胺溶液。拔去鲨鱼齿样品梳，避免拉彻凝胶顶部。用水清洗梳了，准备好在C，2.3操作时重新以样品孔。如果用长城齿梳，小心防止撕裂加样孔C.2预电泳
C.2.1凝胶电泳装置的下层贮液槽加人1×TBE缓冲液，使凝胶夹层能漫泡代2cIi~3cm的一层缓冲液中，放人凝胶求层片用夹子固定在电泳装置【。C2.2上层忙槽倒人1×TF缓冲液，使超过凝胶预部约3cm3.用吸管以1×TBE清洗凝胶项部，C.2.3将清洗-下净的登鱼齿样品梳重新插回凝胶夹层，使其齿部仅可触及避胶，用吸管以1×TBE缓冲液彻底清洗加样孔，以除去零晕的聚闪烯酰胺碎片。C.2.4加样前，在15V/em凝胶的电压降下预电泳约30min.使凝胶预热。C.3加样
C.3.1在剂样前，清洗胍样孔除去浸逝孔中的尿素，C.3.2在NA样品中加人等休积的圳样缓冲液A，盖好盖子，95℃变性5nin，迅速骨-F冰上，每孔加样 2 μl,-~3 μ
C.4电泳
在45W-~70W恒功率下电泳。使凝胶温度保持在约55C。高于此温度可能会造成玻璃平板烨裂或条带弥散·而太低温度可使工NA不究金变性，观察标志染料的迁移以确定电冰时间。C. 5剥胶
从良泳装置中取出凝胶夹层，在自米水下汁洗点至两而玻璃平板表面都冷却为止，将夹层平放在纸GB/T20396---2006
巾上，历口玻璃平板（短平板）朝上，除去多余的液体及夹手，取出一边的垫片，两片玻璃平板之间插入一个长金属铲子，轻轻转动铲子将啵璃半板握起使之分升，C.6银染
心. 6. 1 固定
将粘有胶的玻璃板放入1500ml,~2000ml.银染固定液中，使固定液没过凝胶，于摇床上30x/min轻轻摇动固定20ttin-30min。C.6.2漂洗
取出玻离板，放人去离子水中漂洗2碳，每淡3“静o
C.6.3染色
将玻璃板放入1500g瓶1.~
C.6.4显影
取出坡瑙板，彼素
209Q架爸羧串恢染色液漫过凝胶，摇床上轻轻摇动染色。液中，在摇床上显影至条带清晰为止志高冰水中源
C.6.5终止
将玻璃板取放发休积分数类
C.6.6漂洗
将玻璃板蔽入垂离子水中漂溪
原1后，题馨野照相记录结果。
腋中，终建
施 2 min
注：附录态别的景、电山床等参数陷8
能有所不同
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