【国家标准(GB)】 禽流感病毒NASBA检测方法

GB/T19440--2004
禽流感由正粘病毒科流感病毒属中A型流感病毒引起，其中高致病性禽流感因其传播快、危害大，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类疾病，我国将其列为一类动物疫病。依赖核酸序列的扩增技术（NASBA)检测禽流感病毒的敏感性与经典的鸡胚病原分离方法相当，并具有检测速度快、特异性强、与鸡胚病原分离方法符合率高、易于操作的特点。本标准是在综合我国科研成果的基础上，参考OIE《诊断试验和疫苗标准手册》（2000年版），并结合我国现有动物卫生法规及农业部对禽流感的相关政策和措施制定的。本标准附录A、附录B、附录C为规范性附录，附录D为资料性附录。本标准由上海市质量技术监督局和中华人民共和国上海出人境检验检疫局提出。本标准由国家质量监督检验检疫总局归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、上海市质量技术监督局、香港基因晶片开发有限公司。
本标准起草人：单松华、刘乐庭、倪且红、胡永强、李树清。１范围
禽流感病毒NASBA检测方法
GB/T19440—2004
本标准规定了NASBA快速检测禽流感病毒技术规范的材料准备、操作方法和结果判定。本标准适用于离类、禽肉产品中所有亚型禽流感病毒的快速检测、诊断。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注且期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T189362003高致病性禽流感诊断技术3原理
NASBA(Nucleicacid sequence-based amplification.NASBA，依赖核酸序列的扩增技术）是一项连续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术。该技术使用三种酶（反转录酶、核糖核酸酶H、噬菌体T7核糖核酸聚合酶)和两条寡核苷酸引物。上游引物5'末端含有噬菌体T7的依赖于DNA的RVA聚合酶的启动子序列，下游引物的5'末端含有和钉标电化学发光检测探针互补的序列。在扩增步骤中，两个5°端都整合进扩增序列中，这样既成为产生互补RVA序列的模板，又能特异性结合检测步骤中的ECI探针。扩增底物与ECI.探针形成复合物，携带该复合物的磁珠被电极的表面磁性捕获。电极上的电压引起电化学发光(ECI)反应。已杂交上的钉标磁珠发出的光和扩增反应产生的RNA扩增产物总量成比例对应。
4材料准备
4.1试验环境
于净的环境，最好分区。分为核酸提取、核酸扩增和核酸检测三个区4.2器材
采用常规的分子生物学器材，包括：一次性于套、移液器（量程5μL到200μI）、枪头、无RNA酶的1.5mI.塑料离心管、1.5mL离心管架、5mI试管架、旋涡振荡器、计时器、高速台式离心机、瀛度计（精度士2℃）、加热器、水浴锅、5mL聚内烯试管（VWR）、封口膜。如果采用EL方法，需要NucliSens阅读器或者其他等同仪器。如果采用FI.ISA方法，需要酶标仪。4.3引物
上游引物 AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG AAGG A(A/G)G GCA TT(C/T) TGG ACAAA(G/T) CGT CTA
GAT GCA AGG TCG CAT ATG AGG AGA CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG下游引物（
4.4检测试剂
所有检测试剂在使用前，使其达到室温。a）裂解缓冲液：5mol/L异硫氰酸胍,10%TritonX-100,10 mmol/LTris-HCl,pH8.3；b）冲洗缓冲液：5mol/I异硫氰酸胍，1o mmol/I.Tris-HCl.pH8.3；1
GB/T19440—2004
500mg/ml.硅土：500mg/mL盐酸活化的二氧化硅；c）
d）洗脱缓冲液:10 mmol/LTris-HCI.pH 8.3；酶溶液（参见附录A)；
f）捕捉探针：10mmol/I.生物素化寡聚核苷酸；探针序列为 Biotin CCG TCA GGC CCC CTC AAA GCC GA电化学发光法属别检测探针（1OmMgenericECLdetectionprobe）：钉标记的DNA寡聚核g
苷酸；
ECI 序列为 GAT GCA AGG TCG CAT ATG AG CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG TAh）仪器调试参照液：10 mmol/INASBA CP；1 mmol/L ‘Tris-HCl pH8.3；3 mmol/LNASBA-ECL;
检测稀释液:15mmol/1.Tris-HCl,pH 8.3；）bzxz.net
分析缓冲液:50 mmoi/LTris-HCl,pH 8.3;1XPBS(137 mmol/INaCl，2.7 mmol/I.KCl,j）
10 mmol/L NaHPO, 2 mmol/L KH,PO);清洗液：100mmol/LK0H10%SDS,10%TritonX-100;k）
1）无水乙醇alcohol。
4.5样品采集、保存、处理
按GB/T18936—2003中2.1进行。5操作方法
核酸释放和提取
按以下顺序：
将0.1ml.样品加入盛有0.9ml.裂解缓冲液的管中并振荡混合；a）
振荡混合硅土悬浮液并向每个管中加人50μL；b）
振荡混合均匀；
室温下温育10min（每2min振荡混合一次，防止硅土沉淀）；d)
在12000r/min下离心裂解缓冲液管30s；小心移除上清液（不要搅动沉淀）后，向每个管中加入1ml冲洗缓冲液；f）
振荡混合直至管中沉淀重新完全悬浮为止；g）
在12000r/min下离心30s，然后移除上清液；h）
重复第f)步到第h)步的步骤。依次为一次使用冲洗缓冲液；两次使用70%乙醇；最后一次使i）
用100%乙醇；
最后一次洗涤步骤后，用移液器小心移除残余乙醇；j）
使用加热器在56℃1.干燥硅土10min（用薄纸覆盖每个管避免污染）；k）
干燥后向每个管加人50μI洗脱缓冲液；振荡试管直至沉涎物再次重新完全悬浮；m）
56℃温育硅土悬浮液10min以洗脱核酸（5min后开始振荡试管）；n）
在12000r/min下离心2min：
p）将5μl核酸上清液转移至新试管，在1h内开始扩增反应。以上步骤也可采用Qiagen试剂盒或者其他等同试剂盒进行。5.2核酸扩增
按以下顺序：
a）向上述5μL核酸[5.1p)中加人10μl扩增试剂（参见附录A）；b）65℃温育5min;
41℃温育5min；
加入5uI酶溶液（参见附录B），并用手指轻轻扣击试管促使混合均匀；放回试管，并继续在41℃温育5min；将试管稍作离心后，在41℃温育90min；g）
检测扩增产物；
在一70℃下保存扩增产物不超过30d。h)
3核酸检测
按照以下步骤或用ELISA进行检测：将（Nl)十2)个5mL聚丙烯试管进行编号。试管1作为空白对照；a）
振荡混合，除了试管1外，其余试管各加人20μI杂交溶液（参见附录C)；试管2中加人5μL检测稀释液作为空白对照；其余试管各加5μLRNA扩增产物；封口膜封住所有试管，振荡混合；e）
所有试管41℃温育30min。每10min混合一次；除了试管1外，其余试管各加入0.3mL分析缓冲液；g）
振荡仪器调试参照液直至不透明，然后加0.25ml.IRS到试管1；h)
把试管放在转盘式传送盘的适当位置上；j）运行NucliSens 阅读器，对数据进行分析和解释（参见附录D)。6结果判定
GB/T19440-2004
通过大量分析已知阴性对照样品后，确定NASBA/ECL的临界值为0.15X仪器参照溶液的数值样品的读数超过临界值时，判为禽流感病毒阳性，低于临界值时，判为禽流感病毒阴性。1）N为样品数。
GB/T 19440--2004
A.1配制材料
附录A
（规范性附录）
扩增试剂的配制
a）球状骨针：单个球状骨针为10mg,4mmol/I.NTP,15mmol/LDTT,40mmol/I.MgCl2；b）球状骨针稀释剂:100mmol/LTris-HClpH8.3，2mmol/LdNTP;100mmol/.氯化钾溶液；
d）10 mmol/I.引物混合物；
DEPC水。
配制过程
单个球状骨针中加80μl球状骨针稀释剂，并迅速振荡均匀；a）
稀释的球状骨针中加人16μL氯化钾溶液和14μlDEPC水，振荡均勾；b)
加人10叫引物混合物，振荡混合；c）
不能离心；
在30min内使用。
附录B
（规范性附录）
酶溶液的配制
配制材料
酶球:单个酶球(6.5mg)含1.3U/μl.AMV-RT,0.5U/μLRNaseH,1.3U/μI.T7RNA聚a)
合酶,100 mmol/I.Tris-HCl,pH 8.3,10%BSA，酶球稀释剂：0.42μg/μLBSA。b)）
B.2酶溶液的制备
单个酶球中加人55uL酶稀释液，将此溶液放置室温至少20min；b）
用手指轻轻扣击试管让酶球充分溶解；不能剧烈振荡任何含酶的溶液；c）
使用前，稍作离心；
在60 min内使用。
C.1配制材料
附录C
(规范性附录）
杂交溶液的配制
a）捕捉探针：10mmol/l.生物素化寡聚核苷酸；GB/T19440—2004
电化学发光法属别检测探针（1omMgenericECLdetectionprobe）：钉标记的DNA寡聚核b)）
苷酸。
C.2杂交溶液制备
振荡通用型捕捉探针和ECL探针直到形成不透明溶液。a）
b）对于N次特异性检测反应，在新试管中混合（N十2）×10μL捕捉探针和（N+2）×10μlECL探针。
使用前稍作振荡。
d）在60 min内使用。
附录D
（资料性附录）
NucliSens阅读器的操作运行
D.1建立一个新的运行程序。
D.1.1打开NucliSens阅读器的个人电脑。D.1.2在开始界面点击“Prime”来执行系统校准。D.1.3机器准备好后，点击“Start”。校准步骤大约持续3min。D.1.4在登人（log-in）界面的用户名（user name）上选择\Service engineer\并且点击Login”。不需要输人密码。
D.1.5在屏幕左上方选择“Routine\菜单然后点击“New run”。D.1.6
在弹出的工作表界面点击\yes”。输人文件名（不超过8个字符）并且点击\ok”。D. 1. 7
一个工作表单会打开，在分析选择栏（selected assay)选择“Free tube”。D. 1.9车
输人样品号并且点击\Add to list”。D.1.10重复上述步骤直到输入所有样品ID。D. 1. 11
输入所有样品号后，点击“Close\键。D.1.12屏幕出现了一张列有所有样品号的工作表。检查工作表，检查无误后点击ok”。D.2确定样品放在转盘式传送盘instrument carousel).上，并且按照计算机中输人的样品ID顺序摆放。D.3在屏幕上方选择“Routine\菜单然后点击“Run worklist”。D.4　出现一个检查弹出窗口，点击“Proceed”。D.5检测开始（每个试管用时大约1.5min）。D.6检测停止后，在屏幕左上方选择“Routine”菜单然后点击“Sample results”或者Assay result”显示结果。
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