【国家标准(GB)】 H5亚型禽流感病毒NASBA检测方法

GB/T19439—2004
高致病性禽流感由正粘病毒科流感病毒属中A型流感病毒引起，世界动物卫生组织(OIE)列为A类疾病,我国将其列为一类动物疫病。依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)检测禽流感病毒的敏感性与经典的鸡胚病原分离方法相当，并具有检测速度快、特异性强、与鸡胚病原分离方法符合率高、易于操作的特点。本标准是在综合我国科研成果的基础上，参考OIE《诊断试验和疫苗标准手册》（2000年版），并结合我国现有动物卫生法规及农业部对禽流感的相关政策和措施制定的。本标准附录A、附录B、附录C为规范性附录,附录D为资料性附录。本标准由上海市质量技术监督局和中华人民共和国上海出入境检验检疫局提出。本标准由国家质量监督检验检疫总局归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、上海市质量技术监督局、香港基因晶片开发有限公司。
本标准起草人：单松华、陈家华、谢燕、杨锡全、倪旦红、刘乐庭、刘俊平。1范围
H5亚型禽流感病毒NASBA检测方法GB/T19439—2004
本标准规定了NASBA快速检测H5亚型禽流感病毒技术规范的材料准备、操作方法和结果判定。本标准适用于禽类、禽肉产品中H5亚型禽流感病毒的快速检测、诊断。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T18936-2003高致病性禽流感诊断技术3原理
NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA，依赖核酸序列的扩增技术）是一项连续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术。该技术使用三种酶（反转录酶、核糖核酸酶H、噬菌体 T7核糖核酸聚合酶)和两条寡核苷酸引物。上游引物5'末端含有噬菌体T7的依赖于DNA的RNA聚合酶的启动子序列，下游引物的5'末端含有和钉标电化学发光检测探针互补的序列。在扩增步骤中，两个5端都整合进扩增序列中，这样既成为产生互补RNA序列的模板，又能特异性结合检测步骤中的ECI探针。扩增底物与ECI.探针形成复合物，携带该复合物的磁珠被电极的表面磁性捕获。电极上的电压引起电化学发光（ECL)反应。已杂交上的钉标磁珠发出的光和扩增反应产生的RNA扩增产物总量成比例对应。bzxz.net
4材料准备
4.1试验环境
干净的环境，最好分区。分为核酸提取、核酸扩增和核酸检测三个区。4.2器材
采用常规的分子生物学器材，包括：一次性手套、移液器（量程5μL到200μL）、枪头、无RNA酶的1.5ml.塑料离心管、1.5mL离心管架、5mL试管架、旋涡振荡器、计时器、高速台式离心机、温度计（精度土2℃）、加热器、水浴锅、5mL聚丙烯试管（VWR）、封口膜等。如果采用ECL方法，需要NucliSens阅读器或者等同的仪器。如果采用ELISA方法，需要酶标仪。4.3引物
上游引物AAT TCT AATACG ACTCACTATAGG GAGAAGG CCAIAAAGA(C/T)AGACC AGC TA
下游I物 GAT GCA AGG TCGCAT ATG AGG AGA GAA GAA GAA AAA AGA GAGGAC4.4检测试剂
所有检测试剂在使用前，使其达到室温。a）裂解缓冲液：5mol/L异硫氰酸胍，10%TritonX-100,10mmol/1.Tris-HCl,pH8.3；b）冲洗缓冲液：5mol/1.异硫氰酸胍，10mmol/LTris-HCl,pH8.3；c）500mg/ml.硅土：500mg/ml盐酸活化的二氧化硅；1
GB/T19439---2004
d）洗脱缓冲液:10 mmol/L.Tris-HCl,pH 8.3;e）酶溶液（参见附录A)；
f）H5捕捉探针：10 mmol/l.生物素化寡聚核苷酸：探针序列为 Biotin-GC(A/G）AGT TC(C/T) CTA GCA CTG GCA ATg）电化学发光法属别检测探针（10mMgeneric FCLdetection probe）：钉标记的DNA寡聚核苷酸；
ECL 序列为 GAT GCA AGG TCG CAT ATG AG GT GA(C/T) AAT GAA TG(C/T)ATG GAA
h）仪器调试参照液：10 mmol/LNASBACP；1mmol/LTris-HClpH8.3；3mmol/LNASBA-ECL;
检测稀释液：15 mmol/LTris-HCl,pH8.3；分析缓冲液:50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.3;1XPBS(137 mmol/L NaCl, 2,7 mmol/L KCl, 10j）
mmol/L Na2 HPO4, 2 mmol/L KH,PO);k） 清洗液:100 mmol/L KOH,10%SDS,10% Triton X-100;1）无水乙醇。
4.5样品采集、保存、处理
按GB/T18936—2003中2.1进行。5操作方法
核酸释放和提取
按以下顺序：
a）将0.1ml样品加入盛有0.9mL裂解缓冲液的管中并振荡混合；b)
振荡混合硅土悬浮液并向每个管中加人50μL；振荡混合均勾；
室温下温育10min（每2min振荡混合一次，防止硅土沉淀）；e)
在12000r/min下离心裂解缓冲液管30s；小心移除上清液（不要搅动沉淀）后，向每个管中加入1mL冲洗缓冲液；g）
振荡混合直至管中沉淀重新完全悬浮为止；h）
在12000r/min下离心30s，然后移除上清液；i）
重复第f)步到第h)步的步骤。依次为一次使用冲洗缓冲液；两次使用70%乙醇；最后一次使用100%乙醇；
最后一次洗涤步骤后，用移液器小心移除残余乙醇；j）
使用加热器在56℃敲口干燥硅土10min（用薄纸覆盖每个管避免污染）；1
于燥后向每个管加入50uL洗脱缓冲液；m）
振荡试管直至沉淀物再次重新完全悬浮；56℃温育硅土悬浮液10min以洗脱核酸（5min后开始振荡试管）；n）
在12000 r/min下离心2 min;
将5μL核酸上清液转移至新试管，在1h内开始扩增反应。p）
以上步骤也可采用Qiagen或者等同的其他试剂盒进行。5.2核酸扩增
按以下顺序：
a）向上述5μL核酸[5.1p)]中加入10μl扩增试剂（参见附录A)；b）65℃温育5min；
c）41℃温育5min；
加人5uL酶溶液（参见附录B)，并用手指轻轻扣击试管促使混合均匀；d)
放回试管，并继续在41℃温育5min；将试管稍作离心后，在41℃温育90min；检测扩增产物；
在一70℃下保存扩增产物不超过30d。5.3核酸检测
按照以下步骤或用ELISA进行检测：将（N1）+2）个5mI.聚丙烯试管进行编号。试管1作为空白对照；a)
振荡混合，除了试管1外，其余试管各加人20μL杂交溶液（参见附录C)；b)
试管2中加人5uL检测稀释液作为空白对照；其余试管各加5μLRNA扩增产物；封口膜封住所有试管，振荡混合；所有试管41℃温育30min。每10min混合一次；除了试管1外，其余试管各加人0.3mL分析缓冲液；振荡仪器调试参照液直至不透明，然后加0.25mLIRS到试管1；h)
把试管放在转盘式传送盘的适当位置上；j）
运行NucliSens阅读器，对数据进行分析和解释（参见附录D）。6结果判定
GB/T 19439--2004
通过大量分析已知阴性对照样品后，确定NASBA/ECL的临界值为0.15X仪器参照溶液的数值。样品的读数超过临界值时，判为H5亚型禽流感病毒阳性，低于临界值时，判为H5亚型禽流感病毒阴性。
1）N为样品数。
GB/T19439—2004
A.1配制材料
附录A
(规范性附录）
扩增试剂的配制
球状骨针：单个球状骨针为1o mg，4 mmoi/LNTP,15mmol/LDTT,40 mmol/LMgCl2；a）
b）球状骨针稀释剂：100mmol/LTris-HClpH8.3，2mmol/LdNTP；100mmol/L氯化钾溶液；
d）10 mmol/LH5引物混合物；
DEPC水。
A.2配制过程
单个球状骨针中加人80uL球状骨针稀释剂，并迅速振荡均匀；稀释的球状骨针中加人16μI氯化钾溶液和14μLDEPC水，振荡均匀；加入10μlH5引物混合物，振荡混合；不能离心；
在30 min内使用。
附录B
（规范性附录）
酶溶液的配制
B.1配制材料
a）酶球:单个酶球(6.5 mg)含 1.3 U/μLAMV-RT,0.5 U/μl.RNase H,1.3U/μL T7 RNA聚合酶,100 mmol/L Tris-HCl,pH 8.3,10%BSA;b）酶球稀释剂:0.42μg/μulBSA。2酶溶液的制备
单个酶球中加人55μL酶稀释液，将此溶液放置室温至少20min；b)
用手指轻轻扣击试管让酶球充分溶解；c)
不能剧烈振荡任何含酶的溶液；使用前，稍作离心；
在60min内使用。
附录C
（规范性附录）
杂交溶液的配制
C.1配制材料
a）H5捕捉探针：10mmol/L生物素化寡聚核苷酸；4
GB/T 19439—2004
b）电化学发光法属别检测探针（10mMgenericECLdetectionprobe）：钉标记的DNA寡聚核苷酸。
C.2杂交溶液制备
a）振荡H5捕捉探针和ECL探针直到形成不透明溶液。对于N次特异性检测反应，在新试管中混合（N+2）×10μLH5捕捉探针和（N+2）×10μlb）
ECL探针。
使用前稍作振荡。
在60 min 内使用。
附录D
（资料性附录）
NucliSens阅读器的操作运行
D.1建立一个新的运行程序。
D.1.1打开NucliSens阅读器的个人电脑。D.1.2在开始界面点击“Prime\来执行系统校准。D.1.3机器准备好后，点击“Start”。校准步骤大约持续3min。D.1.4在登人（log-in）界面的用户名（user name）上选择\Serviceengineer”并且点击\Login”。不需要输人密码。
D.1.5在屏幕左上方选择“Routine”菜单然后点击“New run”。D.1.6在弹出的工作表界面点击“yes”。D.1.7输人文件名（不超过8个字符)并且点击ok”。D. 1.8
一个工作表单会打开，在分析选择栏（selected assay)选择\Free tube”。D.1.9输人样品号并且点击\Add to list”。D. 1. 10
重复上述步骤直到输人所有样品ID。输人所有样品号后，点击“Close”键。D. 1. 11
D.1.12屏幕出现了一张列有所有样品号的工作表。检查工作表，检查无误后点击“ok”。D.2确定样品放在转盘式传送盘（instrument carousel）上，并且按照计算机中输人的样品ID顺序摆放。
D.3在屏幕上方选择\Routine\菜单，然后点击\Run worklist”。D.4出现一个检香弹出窗口，点击“Proceed”。D.5检测开始（每个试管用时大约1.5min）。D.6检测停止后，在屏幕左上方选择“Routine”菜单，然后点击“Sample results”或者Assayresult”显示结果。
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。