【国家标准(GB)】 H9亚型禽流感病毒荧光RT－PCR检测方法

GB/T 19438.4—2004
GB/T19438—2004
《禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分：GB/T19438.1—2004《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》；《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》；-GB/T19438.2—2004
-GB/T19438.3—2004《H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》；-GB/T19438.4—2004《H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》。本部分的附录A是资料性附录。
本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本部分起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司本部分主要起草人：张利峰、张鹤晓、刘继红、郭晋优、刘艳华、杨伟。I
1范围
GB/T19438.4—2004
H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法本部分规定了荧光RT-PCR检测H9亚型禽流感病毒的操作方法。本部分适用于活禽及其产品中H9亚型禽流感病毒的检测。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T19438.1-2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法3缩略语
下列缩略语适用于本部分。
荧光RT-PCR
荧光反转录-聚合酶链反应。
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3.3
核糖核酸。
焦碳酸乙二酯。
磷酸盐缓冲盐水。
Taq酶
Taq DNA聚合酶。www.bzxz.net
4原理
H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法是采用TaqMan技术。设计一对仅在H9亚型禽流感病毒血凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探针的5'端和3'端分别标记不同的荧光素，如5'端标记FAM荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团（用R表示），3'端一般标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5'端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团（用Q表示）。
当PCR反应在退火阶段时，一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发1
GB/T19438.4--2004
出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号；当PCR反应进行到延伸阶段时，TaQ酶在引物的引导下，以四种核苷酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链；当链的延伸进行到探针结合部位时，受到探针的阻碍而无法继续，此时的Taq酶发挥它的5'→3'外切核酸酶的功能，将探针切成单核苷酸，消除阻碍，与此同时标记在探针上的R基团游离出来，R所发出的荧光再不为Q所吸收而被检测仪所接收；在Taq酶的作用下继续延伸过程合成完整的新链，R和Q基团均游离于溶液中，仪器可继续检测到R所发出的荧光信号。5材料与试剂
5.1试剂
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器（用DEPC水处理后高压灭菌)分装。
5.1.1三氯甲烷。
5.1.2异丙醇（-20℃预冷）。
5.1.3PBS：配方见GB/T19438.1--2004中附录A。121℃士2℃，15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加人青霉素、链霉素各10000IU/mL。5.1.475%乙醇：用新开启的无水乙醇和无RNA酶的水配制，一20℃预冷。5.1.5H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒\：组成、说明及使用注意事项参见附录A。5.2仪器与器材
5.2.1荧光RT-PCR检测仪。
5.2.2高速台式冷冻离心机（最高转速12000t/min以上）。5.2.3
台式离心机（最高转速2000r/min）。5.2.4混匀器。
5.2.5冰箱（2℃～8℃和-20℃两种）。5.2.6可移动紫外灯。
5.2.7微量可调移液器及配套带滤芯吸头（10μL、100μL、1000μL）。5.2.8专用毛细玻璃管或PCR管。5.2.9Eppendorf 管(1.5mL)。
6抽样
6.1采样工具
下列采样工具必须经121℃士2℃，15min高压灭菌并烘干：——棉拭子；
—剪刀、镊子；
—注射器；
1.5mLEppendorf 管；
研钵。
6.2样品采集
6.2.1活禽
取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下：取咽喉拭子时将拭子深人喉头口及上颚裂来回刮3次～5次取咽喉分泌液；1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。一取泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔转一圈并沾取少量粪便；GB/T 19438.4--2004
一将同一样品的咽喉拭子和泄殖腔拭子一并放人盛有1.0mLPBS的1.5mLEppendorf管中，加盖、编号。
6.2.2肌肉或组织脏器
待检样品装人一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。6.2.3血清、血浆
用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。6.3样品储运
样品采集后，将采集的样品放人密闭的塑料袋内（一个采样点的样品，放一个塑料袋），于保温箱中加冰、密封，送实验室。
6.4样品制备
6.4.1咽喉、泄殖腔拭子
样品在混勾器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30min，取上清液转入无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用。6.4.2肌肉或组织脏器
取待检样品2.0g于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mL.PBS混匀，4℃、3000r/min离心15min，取上清液转人无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用。6.5样本存放
样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应放在一70℃以下冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。
7操作方法
7.1实验室的设置与管理
实验室的设置与管理见GB/T19438.1—2004中附录C。7.2样本的处理
在样本制备区进行。
7.2.1取n个灭菌的1.5mLEppendorf管，其中n为被检样品、阳性样品与阴性样品的和（阳性样品、阴性样品在试剂盒中已标出），做标记。7.2.2每管加人600μL裂解液，分别加人被检样本、阴性对照、阳性对照各200μL，-份样本换用一个吸头，再加人200uL三氯甲烷，混匀器上振荡混匀5s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混勾）。于4℃、12000r/min离心15min。7.2.3取与7.2.1相同数量灭菌的1.5mLEppendorf管，加人500μL异丙醇（一20℃预冷），做标记。吸取7.2.2各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500μL，不能吸出中间层，颠倒混勾。
7.2.4于4℃、12000r/min离心15min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）；加人600μuI，75%乙醇，颠倒洗涤。
7.2.5于4℃、12000r/min离心10min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干）。7.2.64000r/min离心10s(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清液，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3min，不能过于干燥，以免RNA不溶。7.2.7加人11μI.DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提GB/T19438.4-—2004
取的RNA须在2h内进行PCR扩增；若需长期保存须放置于一70℃冰箱。7.3检测
7.3.1扩增试剂准备
在反应混合物配制区进行。
从试剂盒中取出相应的荧光RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2000r/min离心5 s。设所需荧光RT-PCR检测总数为n，其中n为被检样品、阳性样品与阴性样品的和，每个样品测试反应体系配制见表1。
表1每个样品测试反应体系配制表试剂
RT-PCR反应液/μL
Taq酶/μL
根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，加入到适当体积试管中，按每四份样品加入一一颗RT-PCR反转录酶颗粒，计算应加入的酶颗粒数，充分混合均勾，向每个荧光RT-PCR管中各分装15uL反应混合物液体，转移至样本处理区。7.3.2加样
在样本处理区进行。
在各设定的荧光RT-PCR管中分别加人7.2.7中制备的RNA溶液各10uL，盖紧管盖，500r/min离心30s。
7.3.3荧光RT-PCR检测
在检测区进行。
将7.3.2中离心后的PCR管放人荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。循环条件设置：
-第一阶段，反转录42℃/30min；一第二阶段，预变性92℃/3min；第三阶段，92℃/10s，45℃/30s，72℃/1min，5个循环；第四阶段，92℃/10s，60℃/30s，40个循环，在第四阶段每次循环的退火延伸时收集荧光。试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。8结果判定
8.1结果分析条件设定
直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
8.2质控标准
8.2.1阴性样品无Ct值或无扩增曲线。8.2.2阳性对照的Ct值应小于28.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。8.3结果描述及判定
8.3.1阴性
无Ct值或无扩增曲线，表示样品中无H9亚型禽流感病毒。8.3.2阳性
Ct值小于等于30.0,且出现典型的扩增曲线，示样品中存在H9亚型禽流感病毒。8.3.3有效原则
Ct大于30.0的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。4
A.1试剂盒组成
附录A
（资料性附录）
H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒的组成每个试剂盒可做48个检测，包括以下成分：裂解液
DEPC水
H9 亚型禽流感病毒 RT-PCR 反应液RT-PCR酶
Taq酶
阴性对照
阳性对照(非感染性体外转录 RNA)A.2说明
30 mL×1盒
1mLX1管
750 μLX1管
1颗/管×12管
12 μI×1 管
1mLX1管
1mL×1管
GB/T19438.4—--2004
A.2.1裂解液的主要成分为异硫氰酸胍和酚，为RNA提取试剂，外观为红色液体，于4℃保存。A.2.2DEPC水，是用1%DEPC处理后的去离子水，用于溶解RNA。A,2.3H9亚型禽流感病毒RT-PCR反应液中含有检测H9亚型禽流感病毒的特异性引物、探针及各种离子。
A.3使用时的注意事项
由于阳性样品中模板浓度相对较高，检测过程中不得交叉污染。A.3.1E
A.3.2反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。A.3.3RT-PCR酶颗粒极易吸潮失活，必须在室温条件下置于干燥器内保存，使用时取出所需数量，剩余部分立即放回干燥器中。
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