【国家标准(GB)】 H7亚型禽流感病毒荧光RT－PCR检测方法

GB/T19438.3—2004
GB/T19438—2004《禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分：-GB/T19438.1—2004《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》；GB/T19438.2-2004《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》；—GB/T19438.3—2004《H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》；GB/T19438.4—2004《H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》。本部分的附录A为资料性附录。
本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本部分起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。本部分主要起草人：高志强、张鹤晓、郭晋优、刘继红、吴丹。1
1范围
H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR
检测方法
本部分规定了荧光RT-PCR检测H7亚型禽流感病毒的操作方法。本部分适用于活禽及其产品中H7亚型禽流感病毒的检测。2规范性引用文件
GB/T 19438.3—2004www.bzxz.net
下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T19438.1—2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法3缩略语
下列缩略语适用于本部分。
荧光RT-PCR
荧光反转录-聚合酶链式反应。
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3.3
核糖核酸。
Taq酶
Taq DNA聚合酶。
磷酸盐缓冲盐水。
焦碳酸乙二酯。
4原理
采用 TaqMan 方法，通过比对禽流感病毒血凝素基因,设计一对仅在 H7亚型禽流感病毒血凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其中5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团（R），3'端标记的TAMRA荧光素（Q)在近距离内能吸收5'端荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团。反应在退火时，引物和探针同时与目的基因片段结合，1
GB/T19438.3-2004
探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Tαq酶发挥5'-3'的外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。
5试剂和材料
5.1试剂
除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯，所用液体试剂均须使用无RNA酶的容器（用DEPC水处理后高压灭菌)进行分装。
5.1.1H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒：试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录A。
三氯甲烷。
5.1.3异丙醇。
5.1.475%乙醇，用新开启的无水乙醇和无RNA酶的水配制。5.1.50.01 mol/L(pH7.2)的PBS:配方见GB/T 19438.1-2004中附录A。121℃±2℃,15min高压灭菌后，无菌条件下按10000IU/mL加人青霉素和链霉素5.2仪器设备
5.2.1高速台式冷冻离心机：要求最大离心力在120001/min以上。5.2.2荧光PCR仪。
5.2.3计算机。
5.2.42℃～8℃冰箱。
—20 ℃冰箱。
微量加样器:0.5μL~~10 μL;5 μL~～20 μL;20 μL~200 μL;200 μL~1 000 μL。5.2.7混勾器。
5.2.8可移动紫外灯：要求近工作台面。6样品的采集与前处理
采样过程中样本间不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。6.1取样工具
需要下列取样工具：
—棉拭子；
剪刀、镊子；
— Eppendorf 管;
研钵。
以上取样工具必须经121℃土2℃，15min高压灭菌并烘干。6.2采样方法
6.2.1活禽样品
取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法为：对于咽喉拭子，采取时要深人喉头及上颚裂来回刮3次～5次取咽喉分泌液；取泄殖腔拭子时，将拭子深人泻殖腔转一圈沾取粪便；1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2
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--将咽喉子和泄殖腔拭子一并放人盛有1.0mLPBS的Eppendorf管中备用。6.2.2肌肉或脏器样品
用无菌的剪刀、镊子取待检样品2.0g于研钵中充分研磨，加10mL.PBS混匀，1000g离心10min后，取上清液转人Eppendorf管中备用。6.2.3血清或血浆
用无菌注射器直接吸取至Eppendorf管内备用。6.2.4保存与运送
采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，长期保存须在一70℃以下，但应避免反复冻融（冻融不超过三次）。样品采集后，将采集的样品密封并编号，采用保温壶或泡沫箱加冰密封尽快运送到实验室。7操作方法
7.1实验室的设置与管理
实验室的设置与管理见GB/T19438.1-2004中附录C。7.2样本的制备
7.2.1在样本制备区进行。
7.2.2样本的制备程序：
7.2.2.1取n个1.5 mL灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数，一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管编号标记。
7.2.2.2每管加人600μL裂解液，然后分别加人待测样本、阴性对照、阳性对照各200μ.，一份样本换用一个吸头；再加人200uL三氯甲烷，混勾器上剧烈震荡混匀5s。于4℃条件下，12000r/min离心15 min。
7.2.2.3取与7.2.2.1中相同数量的1.5ml,灭菌Eppendorf管，加人500uL异丙醇（～20℃预冷），对每个管编号标记。
7.2.2.4吸取7.2.2.2离心后各管中的上清液转移至已加入异丙醇的相应管中，上清液至少吸取500uL，不要吸出中间层，颠倒混匀。7.2.2.5于4℃条件下，12000r/min离心15min，注意固定离心管方向，即将离心管开口朝离心机转轴方向放置。轻轻倾去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品须在吸水纸不同地方沾干。7.2.2.6加人600ul75%乙醇，颠倒洗涤。于4℃条件下，12000r/min离心15min。轻轻倾去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体。7.2.2.74000r/min离心10s将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器将其吸干，一份样本换用个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3min。不宜过于干燥，以免RNA不溶。7.2.2.8加人11uLDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增，长时间保存，须置于一70℃条件下。7.3靶核酸的反转录和扩增
7.3.1扩增试剂准备与配制
7.3.1.1在反应混合物配制区进行。7.3.1.2从试剂盒中取出相应的RT-PCR反应液、Tuq酶，待反应液室温下融化后，2000r/min离心5 s。设所需PCR反应数为n,其中 n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和。每个测试反应体系需使用15μI.RT-PCR反应液及0.25μuLTaq酶。计算各试剂的使用量，加人一试管中，向其中加人0.25Xn颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均勾，向每个PCR管中各分装15μL.转移至样本处理区。7.3.2加样
7.3.2.1在样本处理区进行。
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7.3.2.2在各设定的PCR管中分别加人7.2.2.8制备的RNA溶液各10μL，盖紧管盖后，500/min离心30s。
7.3.3荧光RT-PCR反应
7.3.3.1在检测区进行。
7.3.3.2将7.3.2.2中加样后的PCR管放人荧光PCR检测仪内并记录样本摆放顺序。7.3.4反应参数设置
荧光RT-PCR检测H7亚型禽流感病毒的反应参数为：一第一阶段，反转录42℃/30min；第二阶段，预变性92℃/3min；
一第三阶段，92℃/10s,45℃/30s，72℃/1min，5个循环；第四阶段，92℃/10s.60℃/30$，40个循环，荧光收集设置在第四阶段每次循环的退火延伸时进行。
8结果判定
8.1结果分析条件设定
8.1.1读取检测结果，阈值设定原则以阐值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。8.1.2不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。8.2质控标准
阴性对照的检测结果应没有特异性扩增，阳性对照的Ct值应小于28.08.3结果描述及判定
8.3.1阳性
Ct值小于等于30.0而且出现明显的扩增线，表明样品中存在H7亚型禽流感病毒。8.3.2阴性
无（Ct值并且尤扩增曲线，表明样品中无H7亚型禽流感病毒。8.4有效原则
Ct值大于30.0的样本须重做，重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性4
附录A
(资料性附录)
GB/T19438.3—2004
H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR试剂盒组成、说明、功能及使用时的注意事项A.1试剂盒组成
每个试剂盒（规格为48反应/盒)包括以下成分：裂解液
DEPC水
H7亚型禽流感病毒RT-PCR反应液RT-PCR 酶
Tag酶
阴性对照
阳性对照（非感染性体外转录RNA)）A.2说明
30mL×1盒
1mL×1管
750uL×1管
1颗/管×12管
12 μLX1管
1mLX1管
1mLX1管
A.2.1裂解液的主要成分为异硫氰酸胍和酚，为RNA提取试剂，外观为红色液体，于4℃保存，其他试剂保存于一20℃。
A.2.2DEPC水，是用1%DEPC处理后的去离子水，用于溶解RNA。A.2.3RT-PCR反应液中含有特异性引物、探针及各种离子。A.3使用时的注意事项
由于阳性样品中模板浓度相对较高，检测过程中不得交叉污染。A.3.1
反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。A.3.3RT-PCR酶颗粒极易吸潮失活，必须在室温条件下置于干燥器内保存，使用时取出所需数量，剩余部分立即放回干燥器中。
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