【国家标准(GB)】 H5亚型禽流感病毒荧光RT－PCR检测方法

GB/T19438.2--2004
GB/T19438—2004《禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分：-GB/T19438.1-2004《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》；《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》；GB/T 19438.2-2004
——GB/T19438.3-—2004《H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》；-GB/T 19438.4-—2004
《H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》。本部分的附录A是资料性附录。
本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本部分起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。本部分主要起草人：刘环、张鹤晓、赖平安、周琦、刘宁。1范围
GB/T19438.2—2004
H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法本部分规定了H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR操作方法。本部分适用于活禽及其产品中H5亚型禽流感病毒的检测。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T19438.1—2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法3缩略语
下列缩略语适用于本部分。
荧光RT-PCR
荧光反转录-聚合酶链反应。
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3.3
核糖核酸。此内容来自标准下载网
Taq酶
Taq DNA 聚合酶。
磷酸盐缓冲生理盐水。
焦碳酸乙二酯。
4原理
采用TaqMan方法,在比对禽流感病毒血凝素基因的基础上，设计一对仅在H5亚型禽流感病毒血凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。该探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其中5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3'端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5'端荧光基团发出的荧光信号。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥5'-→3'的外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的1
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R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。5试剂和材料
5.1试剂
除另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器（用DEPC水处理后高压灭菌）分装。
5.1.1三氯甲烷。
5.1.2异丙醇：—20℃预冷。
5.1.375%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20℃预冷。5.1.40.01mol/1(pH7.2)的PBS:配方见GB/T19438.1—2004中附录A。121℃±2℃,15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加人青霉素、链霉素各10000IU/mL。5.1.5H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒\：试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录A。
5.2仪器设备
5.2.1高速台式冷冻离心机：最大离心力12000r/min以上。5.2.2荧光PCR检测仪、计算机。5.2.32℃～4℃冰箱和-20℃冰箱。5.2.4微量加样器:0.5μL-~10μL,5μL20μL,20μL~200μL,200μL~~1000μL。5.2.5组织匀浆器。
5.2.6混勾器。
5.2.7可移动紫外灯。
6样品的采集与前处理
采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。6.1取样工具
下列取样工具必须经121℃士2℃，15min高压灭菌或经160℃土2℃干烤2h。一拭子；
剪、镊；
研钵，
Eppendorf管(1.5mL)。
6.2采样方法
6.2.1活禽样品
取咽喉子和泄殖腔拭子，具体采集方法如下：咽喉拭子，采取时要将拭子深人喉头及上聘裂来回刮3次～5次，取咽喉分泌液；取泄殖腔拭子时，将拭子深人泄殖腔转一圈沾取粪便；—-将咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放人盛有1.0mIPBS的Eppendorf管中，编号备用。6.2.2内脏或肌肉样品
用无菌镊剪夹取待检样品2.0g于研钵中充分研磨，再加10mLPBS混匀，或置于组织匀浆器中，加人10ml.PBS匀浆，然后将组织悬液转人无菌Eppendorf管中3000r/min离心10min，取上清液转1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2
人Eppendorf管中，编号备用。
6.2.3血清或血浆
用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。6.3存放与运送
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采集或处理的样本在2℃~~8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，须放置一70℃冰箱，但应避免反复冻融（最多冻融三次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。
7操作方法
7.1实验室的设置与管理
实验室的设置与管理见GB/T19438.1—2004中附录C。7.2样本的处理
在样本处理区进行。
7.2.1取n个1.5mL灭菌Eppendorf管,其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号。
7.2.2每管加入600μL裂解液，然后分别加人待测样本、阴性对照、阳性对照各200μL，吸头反复吸打混匀（一份样本换用一个吸头），再加人200uI.三氯甲烷，混匀器上震荡混匀5s（不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀）。于4℃条件下，12000r/min离心15min。7.2.3取与7.2.1中相同数量的1.5ml.灭菌Eppendorf管，加人400μL异丙醇（一20℃预冷），对每个管进行编号。吸取7.2.2离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液至少吸取500μL，注意不要吸出中间层，颠倒混匀。
7.2.412000r/min离心15min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾于液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干。加人600μL75%乙醇，颠倒洗涤。7.2.5于4℃条件下，12000r/min离心10min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干。7.2.64000r/min离心10s（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温于燥3min。不宜过于于燥，以免RNA不溶。7.2.7加入11μLDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增或放置于一70℃冰箱。7.3扩增试剂准备与配置
在反应混合物配制区进行。
从试剂盒中取出AIVH5亚型RT-PCR反应液、Tag酶，在室温下融化后，2000r/min离心5s。设所需PCR数为 n，其中 n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，每个样本测试反应体系配制见表1。
表1测试反应体系配制表
RT-PCR反应液/μL
Taq酶/μL
计算好各试剂的使用量，加人一适当体积试管中，向其中加人O.25Xn颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15uL，转移至样本处理区。7.4加样
在样本处理区进行。在各设定的PCR管中分别加人7.2.7中制备的RNA溶液各10μL，盖紧管3
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盖后，500r/min离心30s。
7.5荧光RT-PCR反应
在检测区进行。将7.4中加样后的PCR管放人荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。循环条件设置：
荧光RT-PCR检测H5亚型禽流感病毒的反应参数为：.一第一阶段，反转录42℃/30min；第二阶段，预变性92℃/3min；
第三阶段，92℃/10s，45℃/30s，72℃/1min，5个循环；第四阶段，92℃/10$，60℃/30s，40个循环，荧光收集设置在第四阶段每次循环的退火延伸时进行。
8结果判定
8.1结果分析条件设定
读取检测结果。阅值设定原则以阐值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。8.2质控标准
8.2.1阴性对照无（t值并且无扩增曲线。8.2.2阳性对照的Ct值应小于28.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。8.3结果描述及判定
8.3.1阴性
无Ct值并且无扩增曲线，表示样品中无H5亚型禽流感病毒。8.3.2阳性
Ct值小于等于30.0，且出现典型的扩增曲线，表示样本中存在H5亚型禽流感病毒。8.3.3有效原则
Ct值大于30.0的样本须重做。重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。4
附录A
（资料性附录）
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H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR试剂盒组成、说明及使用时的注意事项A.1试剂盒的组成
组成成分（48反应/盒）
样本处理试剂
裂解液
核酸扩增试剂
H5亚型禽流感病毒RT-PCR反应液RT-PCR酶
Taq 酶(5 U/μL)
DEPC水
对照品
阴性对照
阳性对照（非感染体外转录RNA）A.2说明
30mL×1盒
750μL×1管
1颗/管×12管
12μL×1管
1mL×1管
1mL×1管
1mL×1管
A.2.1裂解液的主要成分为异硫氰酸胍和酚，为RNA提取试剂，外观为红色液体，于4℃保存。A.2.2DEPC水，是用1%DEPC处理后的去离子水，用于溶解RNA。A.2.3RT-PCR反应液中含有特异性引物、探针及各种离子。A.3使用时的注意事项
A.3.1由于阳性样品中模板浓度相对较高，检测过程中不得交叉污染。A.3.2反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。
A.3.3RT-PCR酶颗粒极易吸潮失活，RT-PCR酶在室温条件下必须置于干燥器内保存，使用时取出所需数量，剩余部分立即放回干燥器中。A.3.4除裂解液外，其他试剂一20℃保存。有效期为6个月。
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