【国家标准(GB)】 饲料中维生素E的测定 高效液相色谱法

GB/T17812---1999
饲料中维生素E的测定目前尚无国际标准，本标准是参照瑞士罗氏药品化学有限公司维生素研究部发表的《饲料中维生素、类胡萝下一一现代分析方法》中“用高效液相色谱法测定配合饲料、预混合饲料和浓缩维生素中的dl-α-生育酚”而制定的。在技术内容上参照该法，在编写格式上依据GB/T1.1一1993《标准化工作导则第1单元：标准的起草与表述规则第1部分：标准编写的基本规定》和GB/T1.4-1988《标准化工作导则化学分析方法标准编写规定》。为了使饲料中维生素E测定方法科学、准确、经济、实用，适合于我国不同实验室大量饲料样品的测定，在参照国外分析方法的基础上增加了反相色谱测定条件。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。本标准由国家饲料质量监督检验中心（北京)负责起草。本标准主要起草人：陈必芳、赵小阳、李俊玲。243
1范围
中华人民共和国国家标准
饲料中维生素E的测定
高效液相色谱法
Determination of vitamin E in feeds-High-pressure liquid chromatography本标准规定了饲料中维生素E的测定一一高效液相色谱法。GB/T 17812 1999
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、复合预混料、维生素预混料中维生素E的测定。检测范围为每干克样品中含维生素E的量在1.1IU(dl-α-生育酚1mg)以上。2引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法3方法原理
用碱溶液皂化试验样品，去除脂肪，使试样中天然生育酚释放出来并水解，添加的生育酚乙酸酯为游离的生育酚。乙醚提取未皂化的物质，蒸发乙醚，用正已烷溶解残渣。提取物注入高效液相色谱柱，用紫外检测器在280 nm处测定，外标法计算维生素E(dl-α-生育酚）含量。4试剂和材料
除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水，色谱用水为去离子水，符合GB/T6682中用水规定。
4.1无水乙醚：无过氧化物。
4.1.1过氧化物检查方法：用5mL乙醚加1mL10%碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色，或加0.5%淀粉指示液，水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。4.1.2去除过氧化物的方法：乙醚用5%硫代硫酸钠溶液振摇，静置，分取乙醚层，再用蒸馏水振摇，洗涤两次，重蒸，弃去首尾5%部分，收集馏出的乙醚，再检查过氧化物，应符合规定。4.2乙醇。
4.3正已烷：重蒸馏（或光谱纯）。4.41，4-二氧六环。
4.5甲醇：优级纯。
4.62,6-.二叔丁基对甲酚(BHT）。4.7无水硫酸钠。
4.8氢氧化钾溶液：500g/1。
国家质量技术监督局1999-08-10批准21-1
2000-02-01实施
GB/T 17812—1999
4.9抗坏血酸乙醇溶液5g/L：取0.5g抗坏血酸结晶纯品溶解于4ml.温热的蒸馏水中.用乙醇稀释至100ml，临用前配制。
4.10维生素E(dl-α-生育酚)标准溶液4.10.1dl-α~生育酚标准贴备液：准确称取dl-α-生育酚纯品油剂（USP）100.0mg于100ml棕色容量瓶中.用正已烷溶解并稀释至刻度，混匀，4C保存。该贮备液浓度每毫升含维生素E1.0mg。4.10.2dl-α-生育酚标准工作液：准确吸取dl-α-生育酚贮备液（4.10.1）、用正已烷（4.3)按1：20比例稀释。若用反相色谱测定，将1.00mLdl-α-生育酚标准贮备液置入10ml.棕色小容量瓶中，用氮气吹干，用甲醇（4.5)稀释至刻度，混匀，再按比例稀释。配制工作液浓度为每毫升含维生素E50μg。4.11酚酞指示剂乙醇溶液：10g/L.。4.12氮气（纯度99.9%）。
5仪器、设备
5.1实验室常用设备。
5.2圆底烧瓶，带回流冷凝器。
5.3恒温水浴或电热套。
5.4旋转蒸发器。
5.5超纯水器（或全磨口玻璃蒸馏器）。5.6高效液相色谱仪，带紫外检测器。6试样的制备
选取有代表性的铜料样品至少500g，四分法缩减至100g，磨碎，全部通过0.28mm孔筛、混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。7分析步骤
7.1试验溶液的制备
7.1.1皂化
称取试样配合饲料或浓缩饲料10g，精确至0.001g，维生素预混料或复合预混料1~5g.精确至0.0001g。置入250mL圆底烧瓶中，加50mL抗坏血酸乙醇溶液（4.9），使试样完全分散、浸湿、置于水浴上加热，混合直到沸点，用氮气吹洗稍冷却，加10mL氢氧化钾溶液（4.8），混合均匀，在氮气流下沸腾皂化回流30min，不时振荡防止试样粘附在瓶壁上，皂化结束，分别用5mL乙醇、5ml.水自冷凝管顶端冲洗其内部，取出烧瓶冷却至约40℃。7.1.2提取
定量的转移全部皂化液于盛有100mL乙醚（4.1)的500ml分液漏斗中，用30~50ml.蒸馏水分2～3次冲洗圆底烧瓶并入分液漏斗，加盖、放气，随后混合，激烈振荡2min，静置、分层。转移水相于第二个分液漏斗中.分次用100、60mL乙醚重复提取两次，弃去水相，合并三次乙醚相。用蒸馏水每次100mL洗涤乙醚提取液至中性，初次水洗时轻轻旋摇，防止乳化。乙醚提取液通过无水硫酸钠（4.7）脱水、转移到250mL棕色容量瓶中，加100mgBHT（4.6)使之溶解，用乙醚定容至刻度（Vex）。以上操作均在避光通风柜内进行。
7.1.3浓缩
从乙醚提取液(Vex）中分取一定体积(V.）（依据样品标示量、称样量和提取液量确定分取量）置于旋转蒸发器烧瓶中，在部分真空，水浴温度约50℃的条件下蒸发至干或用氮气吹干。残渣用正已烷溶解（反相色谱用甲醇溶解），并稀释至10mL（V。n）使其获得的溶液中每毫升含维生素E(dl-α-生育酚）50100μg，离心或通过0.45um过滤膜过滤，收集清液移入2mL小试管中.用于高效液相色谱仪分析。245
7.2测定
7.2.1高效液相色谱条件
7.2.1.1正相色谱
GB/T 17812—1999
柱长：12.5cm，内径4mm，不锈钢柱。固定相：硅胶Lichrosorbsi60，粒度5μm。移动相：正已烷+1，4-二氧六环（97十3），恒量流动。流速:1 mEL/min。
温度：室温。
进样体积：20μL。
检测器：紫外检测器，使用波长280nm。保留时间：4.3min。
7.2.1.2反相色谱
柱长：12.5cm，内径4mm，不锈钢柱。固定相ODS(或C18),粒度 5 μm。移动相：甲醇+水（95+5）。
流速:1 mL/min。
温度：室温。
进样体积：20μL。
检测器：紫外检测器，使用波长280nm。保留时间：11.17min。
7.2.2定量测定
按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数和灵敏度（AUFS），色谱峰分离度符合要求（R≥1.5）（中国药典1995版附录）。向色谱柱注入相应的维生素E(dl-α-生育酚)标准工作液（4.10.2.Vs.)和试验溶液（7.1.3.V.)得到色谱峰面积的响应值（Pt、P)，用外标法定量测定。8 结果的计算与表述
8.1计算公式
结果按式(1)计算：bZxz.net
式中：We
P, X Vex X Ven X p X V.
P.XmXV.xVXf.
每千克样品中含维生素E的量，IU（或mg）；一样品质量，g；
提取液的总体积，mL；
-从提取液（Vex）中分取的溶液体积，mL；试验溶液最终体积，ml；
标准溶液浓度，μg/mL；
维生素E标准溶液进样体积，μuL；Vs
从试验溶液中分取的进样体积，uL；与标准溶液进样体积(V.)相应的峰面积响应值；与从试验溶液中分取的进样体积(V)相应的峰面积响应值；(1)
f—转换系数，1国际单位(IU)维生素E相当于0.909mgdl-α-生育酚，或1.0mgdl-α-生育酚乙酸酯。
8.2平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数3位。246
充许差
GB/T17812-1999
同分析者对同--试样同时两次测定（或重复测定）所得结果相对偏差。每·千克试样中dl-α-生育酚含量，mg1～10
相对偏差，%
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