【国家标准(GB)】 饲料中总抗坏血酸的测定 邻苯二胺荧光法

GB/T17816-1999
本标准参考了美国公职分析化学家协会A0AC(1995年版)45.1.14～45.1.16《维生素制品和果汁中的维生素C》、《维生紊制品中的维生素C》和《食品中的总维生素C》的规定，在技术内容上，综合上述三种方法，在操作步骤上作了相应的变更，以便于实际操作。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。本标准由国家饲料质量监督检验中心(武汉)负责起草。本标准主要起草人：屈利文、钱肪。262
1范围
中华人民共和国国家标准
饲料中总抗坏血酸的测定
邻苯二胺荧光法
Determination of total ascorbic acid in feedso-Phenylenediamine fluorometry本标准规定了用邻苯二胺荧光法测定饲料中总抗坏血酸的方法。GB/T17816—1999
本标准适用于单一饲料、配合饲料、预混料及浓缩饲料。不适用以酯化抗坏血酸形式添加的各种饲料中抗坏血酸的测定。
在最终提取液中抗坏血酸最小检出限为0.022μg/mL。2引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T6682--1992分析实验室用水规格和试验方法3方法原理
先将试样中抗坏血酸在弱酸性条件下提取出来，提取液中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，与邻苯二胺（OPDA)反应生成有荧光的喹喔啉(quinoxaline），其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比。另外，根据脱氢抗坏血酸与硼酸可形成硼酸-脱氢抗坏血酸络合物而不与邻苯二胺反应，以此作为“空白”排除试样中荧光杂质的干扰。4试剂
本标准所用试剂，除特殊说明外,均为分析纯。实验室用水应符合GB/T6682中三级水的规格。4.1偏磷酸-乙酸溶液：称取15g偏磷酸，加入40mL冰乙酸及250mL水，加温，搅拌，使之逐渐溶解，冷却后加水至500mL。于4℃冰箱可保存7～10天。4.20.15mol/L硫酸溶液：取10mL硫酸，小心加入水中，再加水稀释至1200mL。4.3偏磷酸-乙酸-硫酸溶液：以0.15mol/L硫酸溶液（4.2)为稀释液代替水，其余同4.1配制。4.450%乙酸钠溶液：称取500g乙酸钠（CH，C00Na·3H,0)，加水至1000mL。4.5硼酸-乙酸钠溶液：称取3g硼酸，溶于100mL乙酸钠溶液（4.4)中。临用前配制。4.6邻苯二胺溶液：称取20mg邻苯二胺，于临用前用水稀释至100ml.。4.7抗坏血酸标准溶液（1 mg/mL）：准确称取50mg抗坏血酸，用溶液（4.1)溶于50mL容量瓶中，并稀释至刻度。临用前配制。
4.8抗坏血酸标准工作溶液（100μg/mL）：取10mL抗坏血酸标准溶液（4.7），用溶液（4.1)稀释至国家质量技术监督局1999-08-10批准2000-02-01实施
GB/T 17816—1999
100ml。稀释前测试pH值，如其pH大于2.2时，则应用溶液（4.3)稀释。4.90.04%百里酚蓝指示剂溶液：称取0.1g百里酚蓝，加0.02mol/L氢氧化钠溶液，在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量为10.75mL，磨溶后用水稀释至250mL。变色范围：pH值等于1.2为红色；pH值等于2.8为黄色；pH值大于4.0为蓝色。4.10活性炭的活化：加200g炭粉于1L盐酸（1+9）中，加热回流1～2h，过滤，用水洗至无铁离子（Fe3）为止，置于110～120℃烘箱中干燥，备用。检验铁离子方法：利用普鲁士蓝反应。将2%亚铁氰化钾与1%盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴入，如有铁离子则产生蓝色沉淀。5仪器、设备此内容来自标准下载网
5.1荧光分光光度计：激发波长350nm，发射波长430nm，1cm石英比色皿。5.2实验室用样品粉碎机。
5.3实验室常用仪器、设备。
6试样制备
取具有代表性样品，用四分法缩分至200g，然后粉碎至过0.45mm（40目）筛，混匀后装于密封容器，保存备用。
7测定步骤
7.1试样中碱性物质量的预检
称取试样1g于烧杯中，加10mL偏磷酸-乙酸溶液（4.1），用百里酚蓝指示剂检查pH值.如呈红色，即可用偏磷酸-乙酸溶液作样品提取稀释液。若呈黄色或蓝色，则滴加偏磷酸-乙酸-硫酸溶液（4.3），使其变红，并记录所用量。
7.2试样溶液的制备
称取试样若干克（精确至0.0001g，含抗坏血酸约2.5~~10mg）于100mL容量瓶中，按7.1预检碱量，加偏磷酸-乙酸-硫酸溶液（4.3)调至pH为1.2，或者直接用偏磷酸-乙酸溶液（4.1）定容，摇匀。如样品含大量悬浮物，则需进行过滤，滤液为试样溶液。7.3测定步骤
7.3.1氧化处理：分别取上述试样溶液（7.2)及标准工作溶液（4.8)100mL于200mL带盖三角瓶中，加2g活性炭（4.10），用力振摇1min，干法过滤，弃去最初数毫升，收集其余全部滤液，即为样品氧化液和标准氧化液。
7.3.2各取10mL标准氧化液于两个100mL容量瓶中分别标明标准”及“标准空白”。7.3.3各取10ml.样品氧化液于两个100mL容量瓶中分别标明“样品”及“样品空白”。7.3.4于标准空白”及\样品空白”溶液中各加5mL硼酸-乙酸钠溶液（4.5），混合摇动15min，用水稀释至 100 mL。
7.3.5“F\标准”及“样品”溶液中各加5mL乙酸钠溶液（4.4），用水稀释至100mL。7.3.6荧光反应：取7.3.4中“标准空白”“样品空白”溶液及7.3.5中“样品”溶液2.0mL，分别置于10mI.带盖试管中。在暗室迅速向各管中加入5mL邻苯二胺溶液（4.6），振摇混合，在室温下反应35min，于激发波长350nm，发射波长430nm处测定荧光强度。7.3.7标准曲线的绘制：取上述\标准”溶液（7.3.5)（抗坏血酸含量10μg/mL)0.5,1.0，1.5和2.0mL标准系列，各双份分别置于10mL带盖试管中，再用水补充至2.0mL。荧光反应按7.3.6。以标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应抗坏血酸含量（ug)为横坐标，绘制标准曲线。261
8分析结果的计算及表示
分析结果按式(1)计算：
GB/T17816-1999
式中：X---每干克试样中含抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总量，mg；C从标准曲线上查得的试样液中抗坏血酸的含量，ug;m·试样质量..;
n—试样溶液的稀释倍数。
所得结果表示到小数点后一位。9允许差
每个试样称取两份试料进行平行测定，以其算术平均值为测定结果。...(1)
在干克饲料中抗坏血酸的含量小于或等于1000mg时，测定结果的相对偏差不大于10%。在每干克饲料中抗坏血酸的含量大于1000mg时，测定结果的相对偏差不大于5%。265
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