【国家标准(GB)】 复合预混料中烟酸、叶酸的测定 高效液相色谱法

GB/T17813—1999
复合预混料中烟酸、叶酸的测定目前尚无国家标准和国际标准，本标准是在查阅国外文献的基础上，经过试验比较选择了用高效液相色谱法测定复合预混料中烟酸、叶酸。该方法与美国公职分析化学家协会（AOAC)方法比较，简便、快速，准确度、精密度效果相当。本标准在技术内容上参照国外方法，确定了标准范围、试剂、测定条件，即反相离子色谱条件和反相缓冲液系统条件。在编写格式上依据GB/T1.1一1993《标准化工作导则第1单元：标准的起草与表述规则第1部分：标准编写的基本规定》和GB/T1.4一1988《标准化工作导则化学分析方法标准编写规定》。
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。本标准由国家饲料质量监督检验中心(北京)负责起草。本标准主要起草人：陈必芳、李兰、梁冬生。218
1范围
中华人民共和国国家标准
复合预混料中烟酸、叶酸的测定高效液相色谱法
Determination of nicotinic acid and folic acidin compoundpremix
High-pressure liquid chromatography本标准规定了复合预混料中烟酸、叶酸的测定高效液相色谱法。GB/T17813—1999
本标准适用于复合预混料和维生素预混料中烟酸、叶酸的测定。测量范围为每千克样品中含烟酸的量在1000mg以上，含叶酸的量在500mg以上。2引用标准
下列标准中所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法3方法原理
试样中的烟酸、叶酸用水-甲醇-乙酸混合溶液提取，将滤液注入高效液相色谱反相柱上进行分离，用紫外检测器在280nm波长处定量测定。4试剂和材料
除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水，色谱用水为去离子水，符合GB/T6682的规定。
4.1甲醇：优级纯。
4.2三乙胺。
4.3冰乙酸。
4.4已烷磺酸钠（PICB6)：c{CH（CH,),SO,Na）=0.005 mol/L{或pECH:（CH),SO,Na］941 mg/L/。
4.5标准溶液配制
4.5.1烟酸标准贮备液：称取经过干燥的烟酸标准纯品25.0mg，置于250ml棕色容量瓶中，用移动相溶解，稀释至刻度，于冰箱保存，可放置一周。4.5.2叶酸标准贮备液：称取经过干燥的叶酸标准纯品25.0mg，置于250ml.容量瓶中，用碳酸钠溶液（4.8)溶解，调至pH7.0定容至刻度，于冰箱保存。4.5.3烟酸、叶酸标准工作液：准确吸取4.5.1和4.5.2各10mL，用移动相稀释至50ml或100mlL.该混合标准溶液置于带盖小瓶贮存，供液相色谱仪分析用，当日使用。国家质量技术监督局1999-08-10批准2000-02~01实施
GB/T 17813—1999
4.6提取液：取500mL去离子水，加10mL冰乙酸（4.3），1.3ml三乙胺（4.2），用去离子水定容至1L，此时pH为3.2,过0.45um滤膜，取上述溶液850mL与150mL甲醇（4.1）混合。4.7磷酸缓冲液：称取4.84g的磷酸氢二钾（KHPO,），9.82g磷酸二氢钾（KH,PO,），溶于去离子水中，加20mL乙腈，用去离子水定容至1L，混匀用20%氢氧化钾调节pH至6.5。4.8碳酸钠溶液：c(Na2CO)=0.1 mol/L。5仪器、设备
5.1实验室常用仪器设备。
5.2超声波水浴。
5.3超纯水装置（Millipore或全磨口玻璃蒸馏器）。5.4离心机:3000r/min。
5.5高效液相色谱仪：带自动进样器、紫外可调波长检验器。6试样制备
选取有代表性的样品至少500g，四分法缩减至100g，磨碎，全部通过0.28mm孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。7分析步骤
7.1试验溶液的制备
称取试样维生素预混料0.5～1g或复合预混料1～5g，精确至0.0001g。置于100mL棕色容量瓶中，加10mL碳酸钠溶液（4.8)，浸湿试样加70mL提取液（4.6)混匀，于超声波水浴上振荡提取15min，用提取液定容至刻度，混合均匀，过滤或离心。再经0.45μum过滤膜过滤至带盖小瓶中，调整该试验溶液的浓度≤5ug/mL，供高效液相色谱分析用。7.2测定
7.2.1色谱条件
7.2.1.1反相离子对色谱条件
柱长：25cm、内径4.0mm不锈钢柱。固定相：ODS(C1)粒度5μm。
移动相：取500mL去离子水，加10mL冰乙酸，1.3ml三乙胺，一小瓶20mL已烷磺酸钠（4.4），用去离子水定容至1L，调节pH为3.2.过0.45um滤膜，取上述溶液850mL与150mL甲醇混合，脱气
流速:1.0 mL/min。
温度：30℃。
进样量：20μL5
检测器：紫外检测器，使用波长275nm。7.2.1.2反相色谱
柱长：25cm，内径4mm，不锈钢柱。固定相:Lichrospher CH-8/11,粒度 5 μm。移动相：2%乙睛磷酸缓冲液（4.7）流速：1.4mL/min。
温度：室温。
进样体积：20μL。
检测器：紫外检测器，使用波长280nm。7.2.2定量测定
GB/T 17813--1999
按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数和灵敏度（AUFS），色谱峰分离度符合要求。用两次以上相应标准工作液对系统进行校正。向色谱柱注入相应的烟酸、叶酸标准工作液（4.5.3V.）和试验溶液(7.1V)得到色谱峰面积响应值(Ps、P,）.用外标法定量测定。8结果的计算与表述
8.1计算公式
结果按式(1)计算：
P × V× p.×V.
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式中--每干克试样中含烟酸或叶酸的量，mgm
试样质量，g；
V--提取液的总体积，mL；
P:-—标准溶液中烟酸或叶酸浓度，μg/mL；V.——烟酸或叶酸标准溶液进样体积，μL；V从试验溶液中分取的进样体积uL.P与标准溶液进样体积(V)相应的峰面积响应值；P——-与从试验溶液中分取的进样体积(V,)相应的峰面积响应值。8.2平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数3位。9允许差
同一分析者对同一试样同时两次平行测定所得结果相对偏差≤士10%。（1）
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