【国家标准(GB)】 银耳中米酵菌酸的测定

ICS67.040
中华人民共和国国家标准
GB/T5009.189—2003
部分代替GB11675-1989
银耳中米酵菌酸的测定
Determination of bongkrekic acid in tremellafuciformisberk
2003-08-11发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2004-01-01实施
本标准代替GB11675—1989《银耳卫生标准》中5.1米酵菌酸的测定。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。GB/T5009.189—2003
本标准由河南省食品卫生监督检验所、河南省南阳地区卫生防疫站负责起草。本标准主要起草人：任中善、马军、赵国庆、张丁、韦喜亭。501
GB/T5009.189—2003
米酵菌酸［bongkrekicacid（BA），即酵米面黄杆菌毒索A（flavotoxinA）是由椰毒假单胞菌(pseudomanascocovenenans）产生的一种可以引起食物中毒的毒索。系统命名为，3-羧甲基-17-甲氧基618，21-三甲基-廿二碳-2，4，8，12，14，18，20-七烯二酸。502
1范围
银耳中米酵菌酸的测定
本标准规定了银耳中米酵菌酸的测定方法。本标准适用于银耳中米酵菌酸的测定。薄层色谱测定法
2原理
GB/T5009.189—2003
试样中的米酵菌酸经提取、净化及浓缩后，根据其在短波紫外光GF254硅胶薄层色谱上显示熙色点的最低检出量测定含量。
3仪器
3.1层析槽（内径长×宽×高，25cm×6cm×4cm）。3.2GF2s硅胶薄层50mm×200mm×0.3mm），自制，经110℃~115℃活化2h~3h，置于燥器中可保存一周。
3.3紫外线灯（波长254nm）。
3.4紫外分光光度计。
4试剂
本标准所用的试剂除特殊规定外，均为分析纯，水为蒸馏水或同等纯度的水，溶液为水溶液。4.1硅胶：GF254层析用。
4.2薄层色谱展开剂：石油醚-无水乙醚-冰乙酸[60+40+1.5]。4.3米酵菌酸标准溶液：称取米酵菌酸标准品，用甲醇配制成每毫升含有米酵菌酸20pg供测定用，置于4℃冰箱中避光保存。
4.4甲醇。
4.5冰乙酸。
4.6石油醚，沸程30℃～60℃。
4.7无水乙醚。
三氮甲烷。
85g/100mL磷酸。
40g/L碳酸氢钠水溶液。
4.116mol/L盐酸。
5分析步骤
5.1米酵菌酸的提取
干银耳试样经粉碎过40目筛后，称取20g，置具塞锥形瓶中，加人甲醇20mL，于室温中避光没泡1h，然后再加人三氮甲烷80mL和85g/100mL磷酸0.2mL，鲜银耳试样经剪碎、磨细及混句后称取10g，加人甲醇16mL于室温中避光浸泡1h，然后再加入三氯甲烷64mL和85g/100ml.的磷酸0.16mL；振荡30min，过滤，干银耳取滤液50mL，鲜银耳取滤液40mL。503
GB/T5009.189-2003
将以上滤液移入分液漏斗中，加入与滤液体积相同的碳酸氢钠水溶液，振摇2min，静置分层，用带自动控制球吸管吸出上层于另一分液斗中，再用碳酸氢钠水溶液重复提取两次，每次10mL，轻摇，静置，将三次碳酸氢钠水层合并，加人三氛甲烷25ml.，振摇2min，静置分层后弃去三筑甲烷层，于分液漏斗中慢慢滴人6mol/L盐酸以调该溶液pH至2～3，加人石油醚（沸程30℃~60℃）50mL（鲜银耳试样加40mL），振摇3min，静置分层，取出石油醚层于梨形瓶中，再重复用石油醚30mL和20mL各提取一次（鲜银耳试样两次均为20mL），将石油醚层并人同一瓶中，于40℃水浴中减压吹气浓缩至干，用甲醇移至带1mL刻度的浓缩管中，于40℃用减压法浓缩至0.2mL以下，并用少许甲醇洗管壁，继续浓缩至干，加甲醇0.125mL，将干物质溶解，混匀，作为样液以供薄层色谱测定用。5.2薄层色谱测定
以薄层板的短边为底边，距底边3cm的基线上用微量注射器滴加20ug/ml.标准液8μL与10μL两个点，以及样液两个点，每点10μL（鲜银耳试样滴加20μL），在样液的一个点上再滴加20μg/mL标液10μL。用展开剂展开16cm，取出挥干。在254nm紫外灯光下观察结果如下：a）标准点应出现黑色点；
b）如样液点在标准点相应位置上末出现熙色点，则试样中米酵菌酸的含量在测定方法灵敏度0.25pg/g以下；如在相应位置上有照色点，而另一点中样液与标准液点重叠，则为阳性，根据样液黑点的强度估计减少滴加微升数，或经稀释后再滴人不同微升数，直至样液与标准色点的强度与面积一致为止。米酵菌酸的比移值为0.22。5.3结果计算
见式(1)。
X = 0.2 >
式中：
X-米醇菌酸含量，单位为微克每克(ug/g)：0.2—米酵菌酸的最低检出量，单位为微克(μg)；V,一加人甲醇溶解的体积，单位为毫升（mL)V2———出现最低检出量时滴加样液的体积，单位为毫升（mL）；D样液的总稀释倍数；
一醇溶解时相当试样的质量，单位为克（g）。5.4确证试验
对含量高的试样可以进一步作确证试验将剩余的阳性样液与空白甲醇液分别经薄层分离后，刮下并收集与米酵菌酸标准相应的色谱带与空白处硅胶。各加甲醇4mL，于室温中浸泡1h～2h，混匀，离心，吸出上清液，以空白硅胶甲醇洗脱液作对照，用紫外分光光度计测定，应在267nm和236nm处有米醇菌酸的两个最高吸收峰。
高压液相色谱测定法
.6原理
试样中的米酵菌酸经提取、净化及浓缩后，根据在高压液相色谱上的出峰面积测定含。7试剂
7.1高压液相色谱洗脱剂：甲醇-水-冰乙酸[75+27十1.7]，在配制前，所用试剂及水均需分别重蒸馅。7.2其他试剂同4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、4.10、4.11。504
8仪器
8.1高压液相色仪。
8.220μL试样环。
8.3紫外检测器，调波长至267nm。8.4积分仪。免费标准下载网bzxz
8.5预柱4.6mm(ID)×5cm，内装Cis硅胶，粒度直径为10μm。GB/T5009.189—2003
8.6分析柱AltexUItrasphereTM-ODS，粒度直径为5μm，4.6mmID)X25cm。9分析步骤
9.1米酵菌酸的提取
同5.1，但最后不用甲醇转移，直接于瓶内加人甲醇0.5mL，将干物质溶解，混勾，取出上清液经离心后，置小试管中，作为样液供商压液相色谱测定用。9.2高压液相色谱测定
高压液相色谱操作条件：流速1.1mL/min，纸速0.5cm/min，检定器灵敏度为将10μg/mL标准液20μL调至满刻度的70%～90%。在做高压液相色谱时，首先用洗脱液平衡分析柱，从进样口装置分别进入不同浓度的标准液与样液各20μL。在米酵菌酸标准峰面积的直线范围内，将样液与标准的峰面积相比以求出试样中米酵菌酸的含量。米酵菌酸的保留时间为17min。9.3结果计算
见式(2)。
式中：
×VxDx1
X-—米酵菌酸的含量，单位为微克每克<μg/g）：m
一米酵菌酸标准溶液的浓度，单位为微克每毫升（ug/mL)；A,—样液的峰面积
A—米醇菌酸标准溶液的峰面积；V
一加人甲醇溶解的体积，单位为毫升（mL)；D样液的总稀释倍数；
9.4确证
甲醇溶解时相当试样的质量，单位为克（g）。如阳性试样还需用薄层色谱法中样液与标准液点重叠的方法确证。（2）
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