【国家标准(GB)】 蔬菜中维生素K1的测定

ICS67.040
中华人民共和国国家标准
GB/T5009.158—2003
蔬菜中维生素K，的测定
Determination of vitaminK,in vegetables2003-08-11发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2004-01-01实施
GB/T5009.158-2003
本标准对应于AOAC.45维生素和营养素部分食物中维生素D的测定（1995年英文版），本标准与AOAC.45的一致性程度为非等效。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所。本标准主要起草人：王竹、王光亚、周瑞华、王国栋、杨月欣。321免费标准bzxz.net
GB/T5009.158—2003
本标推参考AOAC.45维生素和营养素部分食物中维生素D的测定（1995年版）的前处理过程，以磷酸盐处理过的氧化铝为色谱柱，应用高效液相色谱反相柱对蔬菜中维生素K，进行定性及定量分析。322
1范围
蔬菜中维生素K，的测定
本标准规定了蔬菜中维生素K，的测定方法。本标准适用于各类蔬菜、绿色植物及其干制品中维生素K，的测定。本标准方法出限为0.5μg，线性范围为1μg/mL～100μg/mL。2原理
GB/T5009.158-2003
蔬菜中的维生素K,经石油醚提取后，注人经磷酸盐处理的氧化铝色谱柱中进行色谱分离，除去干扰物。收集含维生素K，的淋洗液流分，浓缩定容后注入高效液相色谱柱，用紫外检测器，在248nm处测定。以外标法计算试样中维生素K，的含量。3试剂和材料
色谱用水和有机溶剂使用前均需重新蒸馏。3.1无水硫酸钠：使用前需在150℃的烘箱内烘烤4h～8h，以去除水分。3.20.14mo1/1.硫酸钠溶液：称取20g无水硫酸钠，用蒸馏水溶解后定容至1L。3.3丙葡。
3.4石油醚：沸程30℃~60℃。
3.5乙醚：不含过氧化物。
3.5.1过氧化物的检查方法：用5mL乙醚加1mL0.6mol/L碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色。或加4滴5g/L淀粉液，水层呈蓝色。则该乙醚含有过氧化物需处理后使用。
3.5.2去除过氧化物的方法：重蒸时瓶中加一段纯铁丝，弃去首尾10%部分，收集馏出的乙醚。再检查过氧化物，应符合要求。
3.6洗脱液：石油醚+乙醚（97+3）。3.7甲醇：优级纯。
3.8正已烷：优级纯。
3.9中性氧化铝：层析用，100目～200月。3.9.1氧化铝的处理：取250g中性氧化铝，20g磷酸氢二钠，1.6L水，放人容积为2L的锥形瓶中，置于沸水浴30min，不时摇动。冷却，倒掉上层液体（包括悬浮的细小颗粒），然后用布氏淆斗抽滤。将残留物转至平底玻璃皿中，于150℃干燥箱中烘烤3h～5h至两次称量相差3g以下。烘烤过程中不时揽拌，以避免结块，冷却后放入干燥器中保存。3.9.2失活：将磷酸盐处理的氧化铝（3.9.1)，加人具塞锥形瓶中。按每100g氧化铝加9.0mL水的比例加人去离子水，盖紧瓶塞，蒸汽浴或80℃干燥箱加热3min～5min，剧烈摇动锥形瓶，使氧化铝可以自由流动，无结块。冷却，静置30min，使水分分布均匀。3.9.3氧化铝的检验：取标准使用液1.0mL，用氮气（3.11）吹干，再用石油醚（3.4）溶解定容至1.0mL。然后按5.2.2.1装柱，将标准溶液加入柱上，按5.2.2.2色谱分离步骤进行柱色谱，用旋转蒸发瓶（4.5.1)收集含有维生素K，的洗脱馏分，浓缩，氮气吹干，用正已烷（3.8）定容至1.0mL-。进样，HPLC测定，记录峰面积或峰高（A）。另取标准应用液直接测定，记录峰面积或峰高（A,）。将A与A进行比较，其值在0.97～1.03之间（A/A,），说明柱效较好，氧化铝处理合格。否则需重新进行失活处323
GB/T5009.158—2003
理。如果再次验证比值仍不能达到0.97，则需重新制备氧化铝。3.10维生素K,（纯度>98%）标准溶液。3.10.1维生素K，标准储备液：准确称取50.0mg维生索K，纯品，于50mL棕色容量瓶中，用正已烷溶解并稀释定容至刻度，即储备液浓度为1.0mg/mL。将储备液分装成安，冷冻保存。3.10.2维生素K，标准使用液：准确吸取维生素K，标准储备液（3.10.1)，用正已烷按150比例准确稀释，即该维生素K标准工作液浓度为20μg/mL。3.10.3标准使用液的标定：取维生素K，标准使用液，于波长248nm处，测定紫外吸光度值，比色杯厚度1cm，以正已烷为空白，测定3次，取平均值，按式(1)计算标准工作液浓度。X
×m×10%
式中：
一维生素K，标准使用液浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)；X-
A-—标准使用液平均紫外吸光度值；E——摩尔消光系数20000；
m——维生素K，分子量450.7；
10——由克每升（g/L)换算成微克每毫升(μg/mL)的换算系数。3.11高纯氮气99.9%。
4仪器与设备
4.1实验室常用设备。
4.2打碎机。
4.3恒温干燥箱。
4.4色谱柱，为0.8cm×30cm的玻璃柱。底端收缩变细，装有活塞，活塞上约1cm处有一玻璃筛板，筛板孔径为16μm~30μm。柱上端膨大为容积约30mL的储液池。使用前需干燥。4.5旋转蒸发器。
与旋转蒸发器配套的旋转蒸发瓶：具塞，圆底，容积为150mL。4.6恒温水浴锅。
4.7高速离心机。
与高速离心机配套的小离心管：具塞，容积为1.5mL～3.0mL。4.8紫外分光光度计。
4.9高效液相色谐仪，带紫外检测器。分析步骤（所有操作均需避光进行）5
5.1试样处理
5.1.1新鲜试样：去除杂物，将可食部洗净，擦去表面水分，切碎，用打碎机制备成匀浆。避光低温保存。
5.1.2干制试样，磨碎，过60日筛，混勾，避光低温保存。5.2试样预处理
5.2.1提取
5.2.1.1新鲜试样准确称取2.000g10.000g（维生素K，含量不低于2μg），加至具塞锥形瓶中，加人510倍体积的丙酮（3.3），盖上塞子，振摇3min~5min，静置1min。以下按5.2.1.3操作。5.2.1.2干制试样：称取0.200g~4.000g（维生素K，含量不低于2g），加到研钵中，再加人2~4倍量的无水硫酸钠研磨均匀后，转人锥形瓶，加人25mL丙酮，振摇3min～5min，静置1min。324
GB/T5009.158-2003
5.2.1.3将上清液转移至盛有50mL0.14mol/L硫酸钠溶液的分液漏斗中，用25ml.丙酮分2次~3次洗涤残渣，上清液并入分液漏斗。继续用25mL石油醚（3.4）洗涤锥形瓶3次～4次，至无色为止：并人同一分液漏斗中。振摇1min，静置分层。弃下层水相，反复用0.14mol/L硫酸钠溶液洗涤有机相，至水相澄清为止。将有机相通过盛有无水硫酸钠的漏斗，滤至旋转蒸发瓶中，用石油醚洗涤分液漏斗和无水硫酸钠层，洗涤液并人旋转蒸发瓶。5.2.1.4浓缩与定容：将上述提取液于旋转蒸发器上减压蒸发，水浴温度80℃，蒸发至约1mL，取下旋转蒸发瓶用氮气吹干，加人2.0mL石油醚溶解并定容。备柱色谱用。5.2.2柱色谱
5.2.2.1装柱：取干燥色谱柱，将验证好的氧化铝浸泡于石油醚中，湿法填充色谱柱，使氧化铝自由均勾流下，至柱高为20cm，其上端再加1cm无水硫酸钠。打开活塞，调整流速为每秒1滴。5.2.2.2色谱分离：待石油醚流至柱上端0.5cm时，加1ml.试样提取液，待提取液流至与柱上端平齐时，加2mL石油醚冲洗柱壁。再加10mL石油醚2次，洗涤，弃除流出液。然后，用30mL洗脱液洗脱，用旋转蒸发瓶收集流出液。5.2.2.3浓缩定容：将上述流出液于旋转蒸发器浓缩至近干，取下用氮气吹干后，用正已烷定容为2mL。
5.3测定
将定容液移入小塑料离心管中，离心5min（5000r/min），上清液供HPLC分析。5.3.1高效液相色谱分析条件（参考条件）预柱ultrasphereODS，粒度10μm，规格4.0mm×45mm。分析柱ultrasphereODS，粒度5μm，规格4.6mm×250mm。流动相甲醇+正已烷（98+2)。
流速1.5mL/min。
进样量20μL。
检测器紫外检测器，波长248nm，量程0.01~0.05。5.3.2定量测定
5.3.2.1仪器稳定性测定：按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数和灵敏度（AUFS)，为准确测定，按要求对分析柱进行系统适应性实验。取标准使用液按分析条件进样测定，连续6次，计算峰面积或峰高的平均值、标准差和相对标准差（RSD)，如果RSD<1%，说明仪器稳定性良好，可进行试样测定。
5.3.2.2标准曲线：分别取维生素K，标准使用液0.50，1.00，2.00，4.00,6.00,8.0010.00ml，加入分液漏斗中，按试样提取和柱色谱步骤处理，最后浓缩定容至1.0mL，即标准工作曲线中各点维生素K，含量分别相当于5.0，10.0,20.0，40.0，60.0，80.0，100.0μg/mL。按5.3.1分析条件进行测定，记录峰面积或峰高。以维生素K含量为横坐标，蜂面积或峰高为纵坐标绘制标准曲线。5.3.2.3试样测定，取试样浓缩液（5.2.2.3)，按5.3.1分析条件进样测定。6结果计算
试样中维生素K，的含量按式(2)计算。X=cXViXVX100
式中：
X一-试样中维生素K，的含量，单位为微克每百克（μg/100g）：c—一由标准曲线上查出或回归方程求出的维生素K，结果，单位为微克每毫升（μg/mL)；V-试样提取后定容体积，单位为毫升（mL）；·（2)
GB/T5009.158-2003
Vz--试样柱色谐时的取液量，单位为毫升（mL）V3-—试样柱色谱分离后的定容体积，单位为衰升(mL)；m试样质量，单位为克(g）)。
计算结果保留三位有效数字。
7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。326
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。