【农业标准】 牛流行热微量中和试验方法

中华人民共和国农业行业标准

NY/T 543—2002

牛流行热微量中和试验方法

Micro-neutralization test for bovine ephemeral fever

2002-08-27 发布 2002-12-01 实施

前言

牛流行热（简称BEF）又称牛暂时热、三日热、一日热、僵硬病等，本病在亚、非和大洋洲许多国家均有发生。该病是由弹状病毒科暂时热病毒属牛流行热病毒引起的一种急性、热性传染病，呈周期性流行。在发病期间，对牛的产奶量、使役能力、增重、精液品质都有严重影响，还可导致少数病牛瘫痪，流产甚至死亡。严重危害养牛业的发展。

本标准是根据我国科研成果，与澳大利亚合作研究成果和我国的实践经验制定的。

本标准的附录A、附录B、附录C为规范性附录，附录D为资料性附录。

本标准由农业部畜牧兽医局提出。

本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

本标准主要起草人：白文彬、严隽端。

牛流行热微量中和试验方法

1 范围

本标准规定了牛流行热微量血清中和试验技术。

本标准适用于牛流行热的诊断、免疫监测和流行病学调查。

2 微量血清中和试验

2.1 器材

• 2.1.1 营养液和 0.05%胰酶 EDTA(简称 ATV)液,配制方法见附录 A。
• 2.1.2 细胞及其制备、传代、计数方法,见附录 B。
• 2.1.3 抗原(指示毒)、标准阳性血清、阴性血清由法定单位提供，按说明书使用。抗原毒价以及工作抗原(100 TCID₅₀)测定方法见附录 C。
• 2.1.4 微量滴定板：无菌盖96孔微量滴定板(简称微量板)。
• 2.1.5 微量加样器；25 μL、50 μL 及 100 μL 单道和多道加样器，加样塑料滴头（装量为 25 μL～100 μL,与加样器配套使用）。
• 2.1.6 二氧化碳碳培养箱。

2.2 操作方法

• 2.2.1 灭活

  被检血清以及阴、阳性血清用前均于 56°C水浴锅中灭活 30 min。

• 2.2.2 准备

  制备工作抗原(指示毒)方法(见第 C.1 章),将已知毒价的合格种毒用生长液(见第 A.1 章)稀释成 100 TCID₅₀/mL。

• 2.2.3 定性试验

  2.2.3-1 向微量板的每孔各加 25 μL 生长液。

  2.2.3-2 在第一排加被检血清，每份占 2 孔,每孔 25 μL,混合均匀,即成 2 倍稀释。

  2.2.3-3 用多道加样器从第1孔取 25 μL 液体对应移入第 2 排孔内，混匀即成4倍稀释。再从孔内吸出 25 μL 丢弃。

  2.2.3-4 每孔加工作抗原 25 μL,混匀置 37°C孵育 60 min。

  2.2-3-5 每孔加细胞悬液 100 μL(30 000个细胞）。细胞计数方法见第 B.3 章。

  2.2.3-6 试验对照系统的设置。每批试验的对照系统的设置；标准阳性血清，从第1列至第6列,每列4孔,逐列稀释(即2倍～64倍），标准阴性血清、细胞对照和病毒对照各1列4孔。同时对本试验使用的工作抗原，随同试验再次进行测定。

  2.2-3-7 用灭菌的盖子盖上微量板,置 37°C二氧化碳((CO₂)培养箱内，培养5d。从第3天起逐日记录细胞病变效应(CPE)。

  2.2. 3-8 结果判定;标准阳性血清中和抗价≥64,标准阴性血清、病毒对照排各孔均出现 CPE，工作抗原含量滴定在规定的范围之内(CPE出现的孔数与毒价查阅方法见第 D.1章),细胞对照乳正常情况下,4倍稀释的被检血清剂，两孔都出现CPE时,判为阴性;仅 1孔出现 CPE,被判为可疑,应再重复试验一次;两孔均不产生CPE时,则被判为阳性。