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中华人民共和国卫生行业标准
WS/T 42—1996
血中碳氧血红蛋白的分光光度测定方法
Blood—Determination of carboxyhemoglobin
Spectrophotometric method
| 1996-10-14发布 | 1997-05-01实施 |
中华人民共和国卫生部 发布
中华人民共和国卫生行业标准
血中碳氧血红蛋白的分光光度
测定方法
WS/T 42—1996
Blood—Determination of carboxyhemoglobin
Spectrophotometric method
1 主题内容与适用范围
本标准规定了血中的碳氧血红蛋白的分光光度测定方法。
本法最低检测浓度为2%HbCO。
本标准适用于正常人和接触一氧化碳工人血中HbCO浓度的测定。
2 原理
血液中含有四种血红蛋白成分，即还原血红蛋白(Hb)、氧合血红蛋白(HbO2)、碳氧血红蛋白(HbCO)及微量的变性血红蛋白(MetHb)，用连二亚硫酸钠将HbO2和MetHb还原成Hb，则血液中只存在HbCO(I)和Hb(II)两种成分。I的最大吸收波长在420 nm，II的最大吸收波长在430 nm。测出被检血样在两个波长的吸光度，再利用I与II在两个波长下的摩尔吸光系数计算HbCO的百分浓度。
3 仪器
3.1 分光光度计，10 mm比色杯。
3.2 液体快速混合器。
3.3 采血吸管。
3.4 小玻璃管，25 mm×4 mm，带帽。
3.5 试管，10 mL，具磨口塞，实际能盛15 mL至满。
4 试剂
本标准所用试剂除另有说明者外，均为分析纯试剂。
4.1 实验用水：去离子水或经全玻璃蒸馏器重蒸的水。
4.2 硫酸，ρ20=1.84 g/mL。
4.3 甲酸，85%(m/m)。
4.4 连二亚硫酸钠(Na2S2O4)。
4.5 氮气，高纯。
4.6 氧气，高纯。
4.7 一氧化碳纯气，钢瓶装或自制。制备方法：在装有滴液漏斗和气体导出管的烧瓶中加入甲酸(4.3)，自滴液漏斗滴加浓硫酸，产生的一氧化碳通过内装氢氧化钠水溶液(4.8)的洗气瓶及缓冲瓶后通入样品液中。操作应在良好的通风橱内进行。
4.8 氢氧化钠溶液，20 g/L。
| 中华人民共和国卫生部1996-10-14批准 | 1997-05-01实施 |
4.9 血液稀释液,0.02 mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液。
4.10 肝素溶液,5 g/L。
5 采样、运输和保存
取末梢血约10 μL，直接注入到小玻璃瓶中（事先加入5 g/L肝素溶液40 μL），立即加帽，旋转混匀以防凝血。于保温瓶中加冰运送，置冰箱冰盒内(-8 ℃)保存。一周内分析完毕。
6 分析步骤
6.1 摩尔吸光系数的测定
摩尔吸光系数不易测定。但在本法计算中，可用同一浓度的血样制得Hb及HbCO，测其在420 nm、430 nm下的吸光值来代替，作为常数。测定方法如下：
取不吸烟健康人血（肝素抗凝）用水稀释5倍。取0.3 mL加Tris稀释液(4.9)至90 mL通氧气30 min。从中取4份，每份15 mL于具塞试管中。其中两份通氮气10 min以除去过剩的氧，得到HbO₂液。另两份通纯一氧化碳气10 min，得到HbCO液。立即将HbO₂、HbCO制备液分别转入内盛60 mg连二亚硫酸钠的具塞试管中，混匀，放置10 min测量。读取430 nm和420 nm的吸光光度值，代替摩尔吸光系数（以下简称吸光常数）。
6.2 样品处理和测定
将冷藏的血样于室温放置，用液体混合器混匀。迅速取10 μL(二个平行样)，加入内盛15 mL Tris溶液(4.9)的具塞试管中（若采样后随即分析，可直接吸取10 μL放入内盛15 mL Tris溶液的试管中），加入60 mg连二亚硫酸钠，轻轻混匀放置10 min。用10 mm比色杯以试剂空白为参比，测其在420 nm和430 nm处的吸光度值。
7 计算
按式下计算血中HbCO的浓度。
X = (A420*k2 - A430*k1) / (A420(k2-k1) - A430(k1-k5))式中：X——血中碳氧血红蛋白的浓度，%；
A420*——血样在420 nm的吸光度读数；
A430*——血样在430 nm的吸光度读数；
k1——HbCO在420 nm的吸光常数(6.1)；
k2——HbCO在430 nm的吸光常数(6.1)；
k5——Hb在420 nm的吸光常数(6.1)；
k4——Hb在430 nm的吸光常数(6.1)。
8 说明
8.1 本法检测限（0.02吸光度对应的浓度）为2%HbCO。测定范围：2%～70.5%HbCO。精密度：批间变异系数为1.9%～5.6%(HbCO浓度为9.9%、36.6%、56.8%，n=6)。准确度：中毒病人血样加已知HbCO浓度血测定回收率，平均为95.8%(三个比例，n=8)。
8.2 本法测定所依据的Hb与HbCO含量比例与血红蛋白含量高低无关，因此取血量不需要很准确。吸光度常数测定后只要仪器波长稳定，可较长时间使用。
8.3 空气中有大量氧气，所以血样及制成的待测液接触空气越少越好。实验证明含HbCO20%及近饱和HbCO的待测液，其容器上端空气分别为5～6 mL及20 mL时，较装满或近满者，测定结果HbCO平均下降4.5%及10.2%(n=6)。
