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中华人民共和国卫生行业标准
WS/T 22—1996
血中游离原卟啉的荧光光度测定方法
Blood—Determination of free erythrocyte protoporphyrin
—Fluorometric method
1996-10-14发布 1997-05-01实施
中华人民共和国卫生部 发布
中华人民共和国卫生行业标准
血中游离原卟啉的荧光光度测定方法 WS/T 22—1996
Blood—Determination of free erythrocyte protoporphyrin—Fluorometric method
1 主题内容与适用范围
本标准规定了血中游离原卟啉的荧光光度测定方法。最低检测浓度为5 μg/100 mL。
本标准适用于正常人和接触铅的工人血液中游离原卟啉的测定。
2 原理
用乙酸乙酯-乙酸混合液破坏红细胞，使原卟啉溶出，再用盐酸萃取此溶液中的游离原卟啉，在激发光403 nm、发射光605 nm处显示其荧光峰，根据荧光强度进行定量。
3 仪器
3.1 930型荧光光度计，10 mm荧光比色杯。
3.2 旋涡混合器。
3.3 离心机。
3.4 1/10万天平。
3.5 刻度吸量管，1、2、5、10 mL。
3.6 血红蛋白吸管。
3.7 试管，10 mL，具塞。
3.8 微型称量瓶。
3.9 容量瓶，25 mL、50 mL。
3.10 水泵。
4 试剂
本标准所用试剂除另有说明者外，均为分析纯试剂。
4.1 实验用水：蒸馏水，或具有同等纯度的去离子水。
4.2 盐酸，ρ20=1.19 g/mL。
4.3 乙酸乙酯-乙酸混合液（4+1）。
4.4 盐酸溶液，0.5 mol/L。
4.5 生理盐水，氯化钠8.5 g/L。
4.6 硅藻土生理盐水悬浮液，25 g/L。
4.7 原卟啉标准溶液：
4.7.1 储备液：用十万分之一的天平精确称取1.25 mg原卟啉，加浓盐酸约2.5 mL，待原卟啉溶解后，转入25 mL容量瓶中，用重蒸水淋洗称量瓶，并入容量瓶中，并稀释至刻度。此溶液1 mL=50 μg原卟啉（如为原卟啉钠盐或原卟啉二甲酯则分别应称取1.35 mg和1.28 mg）。
WS/T 22—1996
4.7.2 应用液：取储备液0.1mL置50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯-乙酸混合液稀释至刻度。此溶液1 mL=0.1 μg原叶啉。
4.8 质控样：用标准血样、接触者混合血样或加标血样作质控样。
5 采样、运输和保存
取末梢血20 μL，直接注入到有0.1 mL生理盐水(4.5)的试管内，加塞，混匀，置冰瓶中运送，于4℃冰箱内保存。
6 分析步骤
6.1 仪器操作条件
选用42#（581光电比色计滤光片，420 nm）为激发光滤光片和55#（550±10 nm）荧光滤光片。
6.2 标准曲线的绘制
6.2.1 取6支10 mL具塞试管，按下表配制标准液。
| 管号 | FE P 标准管的配制 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 生理盐水(4.5), mL | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
| 原卟啉标准应用液(4.7.2), mL | 0 | 0.1 | 0.3 | 0.5 | 0.7 | 1.0 |
| 乙酸乙酯-乙酸混合液(4.3), mL | 1.0 | 0.9 | 0.7 | 0.5 | 0.3 | 0 |
| FEP含量, μg | 0 | 0.01 | 0.03 | 0.05 | 0.07 | 0.10 |
6.2.2 各管混合均匀后，各加0.15 mL 2.5%硅藻土悬浮液(4.6)，3 mL乙酸乙酯-乙酸混合液(4.3)。
6.2.3 各管分别置旋涡混合器上混合10~15 s（或振荡30 s）后，于2 000 r/min离心15 min，将上清液分别倒入另一清洁的10 mL具塞试管中，各加4 mL 0.5 mol/L盐酸(4.4)，加塞，于旋涡混合器上混合20~30 s（或振荡3 min），待分层后，用水泵（或毛细吸管）吸去上层有机溶剂，取下层盐酸溶液于荧光光度计上以零管作参比进行荧光强度测定。
6.2.4 以FEP含量为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制标准曲线。
6.3 样品测定
将血样从冰箱中取出，摇匀，加1.0 mL乙酸乙酯-乙酸混合液(4.3)，以下步骤按6.2.2和6.2.3条操作，从标准曲线上查出血液中FEP含量。在测定前及每测定10个样品后，作一次质控样测定。
7 计算
按下式计算血中FEP的浓度：
X = m/V × 1 000
式中：X——血中FEP的浓度，μg/L；
m——由标准曲线上查出血液中FEP含量，μg；
V——分析时所取血量，mL。
8 说明
8.1 本标准的最低检测浓度为5 μg/100 mL血；测定范围0.001~0.1 μg FEP/20 μL血，批间精密度CV=4.3%~7.0%，批内精密度CV=2.4%~5.3%（FEP范围0.01~0.1 μg, n=6）；准确度：血样加标平均回收率为96.6%（加标浓度：0.03、0.05、0.07 μg, n=6）。
