【卫生标准】 尿中对氨基酚的高效液相色谱测定方法

中华人民共和国卫生行业标准

尿中对氨基酚的高效液相色谱测定方法 WS/T 56—1996

Urine—Determination of p-aminophenol—High performance liquid chromatographic method

1 主题内容与适用范围

本标准规定了尿中对氨基酚(PAP)的高效液相色谱测定方法。本法最低检测浓度为0.5 mg/L。本标准适用于接触苯胺的工人尿中对氨基酚的测定。

2 原理

尿样加盐酸加热水解后，酸性下用乙酸乙酯萃取，除去部分干扰物，然后在中性溶液中，用乙酸乙酯萃取尿样中对氨基酚，反相C₁₈柱分离，在254 nm波长下测定。以保留时间定性，峰高定量。

3 仪器

3.1 高效液相色谱仪，紫外检测器。

3.2 恒温水浴。

3.3 全玻璃磨口蒸馏器，2 L。

3.4 微量注射器，10 μL。

3.5 容量瓶，100 mL。

3.6 具塞刻度试管，25 mL。

3.7 玻璃瓶，200~500 mL。

3.8 尿比重计。

4 试剂

本标准所用试剂，除另有说明者外，均为分析纯级试剂。

4.1 实验用水，为去离子水或经全玻璃蒸馏器重蒸留的水。

4.2 盐酸，优级纯，ρ₂₀=1.19 g/mL。

4.3 磷酸氢二钾。

4.4 甲醇，重蒸的。

4.5 乙酸乙酯。

4.6 对氨基酚，升华精制，避光保存。

4.7 对氨基酚标准溶液：准确称取8.0 mg精制对氨基酚(4.6)，加水溶解并加入4滴盐酸(4.2)，加水稀释至100 mL。此溶液1 mL相当于80 μg对氨基酚。

4.8 质控样：用加标的模拟尿，接触者混合尿或加标的正常人混合尿作质控样。

中华人民共和国卫生部1996-10-14批准 1997-05-01实施

5 采样、运输和保存

使用硬质玻璃瓶，收集接触苯胺工人的班末或班后 $2\,\mathrm{h}$ 内的尿。尽快测定比重后，按 $100\,\mathrm{mL}$ 尿样加 $4 \sim 5$ 滴的比例加入盐酸（4.2），$4^\circ\mathrm{C}$ 下可保存 4 天。

6 分析步骤

6.1 仪器操作条件

• 色谱柱：柱长 $25\,\mathrm{cm}$，内径 $4.6\,\mathrm{mm}$，不锈钢柱。
• 柱填料：反相 $\mathrm{C}_{18}$ 键合固定相，$5\,\mu\mathrm{m}$。
• 柱温：$50^\circ\mathrm{C}$。
• 流动相：甲醇 + 水 $=30+70(V/V)$。
• 流速：$1.0\,\mathrm{mL}/\min$。
• 检测器波长：$254\,\mathrm{nm}$。

6.2 空白试验

取 $2\,\mathrm{mL}$ 正常人混合尿样与样品同时测定。

6.3 样品处理

• 6.3.1 取 $2\,\mathrm{mL}$ 尿样于 $25\,\mathrm{mL}$ 试管中，加 $1\,\mathrm{mL}$ 水、$1\,\mathrm{mL}$ 盐酸（4.2），摇匀，加盖。
• 6.3.2 放在沸水浴中加热 $1\,\mathrm{h}$，取出冷至室温，加水补足体积至 $4\,\mathrm{mL}$。加 $5\,\mathrm{mL}$ 乙酸乙酯萃取尿样中部分干扰物质，再加 $5\,\mathrm{mL}$ 乙酸乙酯重复萃取一次，弃掉有机相。于水相中加入 $4\,\mathrm{g}$ 磷酸氢二钾，摇匀。加入 $5\,\mathrm{mL}$ 乙酸乙酯萃取对氨基酚，静置分层，轻轻摇动，使萃取液中的棕色悬浮物下沉。上清液供分析用。

6.4 标准曲线的绘制

• 6.4.1 取 4 支 $25\,\mathrm{mL}$ 试管，按下表配制标准管。

• 6.4.2 以下操作按 6.3.2 条进行。
• 6.4.3 取 $10\,\mu\mathrm{L}$ 萃取物上清液进高效液相色谱仪，按操作条件（6.1）测定。重复进样三次。
• 6.4.4 以对氨基酚浓度为横坐标，各浓度对应的峰高平均值为纵坐标，绘制标准曲线。

6.5 样品测定

• 6.5.1 取 $10\,\mu\mathrm{L}$ 样品及空白样萃取物的上清液（6.3、6.2）分别注入高效液相色谱仪中，按操作条件（6.1）测定。
• 6.5.2 用保留时间定性，峰高定量。对氨基酚色谱图见下图。在测定前后以及每测定 10 个样品后，测定一次质控样。

[图片]

尿中对氨基酚的液相色谱图

7 计算

7.1 按式(1)计算尿样换算成标准比重(1.020)下的浓度校正系数($k$)。

7.2 按式(2)计算尿中对氨基酚的浓度。

式中：$X$——尿中对氨基酚的浓度，mg/L；
$c$ 由标准曲线查得的对氨基酚的浓度，mg/L。

8 说明

8.1 本法的最低检测浓度为0.5 mg/L(空白值的3倍标准差)；测量范围为0～20 mg/L(乙酸乙酯萃取后的浓度)。当尿中对氨基酚浓度为4.0～40.0 mg/L时，变异系数分别为$CV=3.7\%\sim6.9\%$；尿中对氨基酚浓度为3.0～10.7 mg/L时，加标回收率为95.0%～103.8%。

8.2 苯胺在体内的代谢速度快，所以要在班末或班后2 h内采样，以正确地反映接触剂量。采样后应尽早加酸，低温保存。

8.3 尿中对氨基酚部分以结合态存在，为测得对氨基酚总浓度，须将结合态对氨基酚水解。尿样加酸后，于沸水浴中加热1 h，可完全水解。

8.4 水解后的尿样中有一未知组分，在中性条件下能与对氨基酚一起被萃取出来，干扰测定，因此必须先在酸性条件下，用乙酸乙酯预萃取，除掉干扰物。然后再于中性条件下萃取对氨基酚。预萃取过程中对氨基酚基本无损失。

8.5 用碱溶液调节溶液pH值不易控制，而用固体磷酸氢二钾调节，操作简单。但加入量要足够，否则影响萃取率。

8.6 质控样用加标的模拟尿时可考察准确度和精密度。用接触者尿或加标的正常尿时，可考察精密度。但人尿不宜久存。模拟尿只含人尿的大量成分。