【商检行业标准(SN)】 猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒抗体阻断ELISA鉴别试验操作规程

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T 1697—2006

猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒
抗体阻断 ELISA 鉴别试验操作规程

Protocol of blocking ELISA for differentiating antibodies of swine transmissible gastroenteritis virus and porcine respiratory coronavirus

2006-01-26 发布 2006-08-16 实施

前 言

本标准的附录 A、附录 B、附录 C均为规范性附录。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：罗长保、陈茹、刘琳琳。

本标准为首次发布的出入境检验检疫行业标准。

猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒
抗体阻断 ELISA 鉴别试验操作规程

1 范围

本标准规定了猪传染性胃肠炎(TGE)病毒和猪呼吸道冠状(PRC)病毒抗体阻断ELISA鉴别试验的操作技术要求。

本标准适用于猪传染性胃肠炎病毒、猪呼吸道冠状病毒鉴别。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 6682　分析实验室用水规格和实验方法

3 材料

3.1 病毒及细胞

SV：细胞生长在96孔细胞培养板，形成单层后用TGE病毒Miller s株感染，2 h后将细胞病变率不大于10%时固定细胞。

3.2 固定细胞

细胞板用PBS(pH7.4)洗涤1次~2次后，用80%丙酮（预冷-20℃）固定15 min，倒掉丙酮，在通风橱中干燥10 min，然后保存在-20℃备用。

3.3 抗体

生物素标记抗TGE病毒A位点单抗；抗TGE病毒D位点单抗。

4 操作方法

1. 4.1  从-20℃取出板置室温，用PBST（见附录A）室温下(25℃左右)阻断非特异性位点2 h后，甩掉PBST并在纸巾上擦干，加150 μL PBS-T到所有病毒感染孔中。
2. 4.2  再加入50 μL阳性血清到A1和A2、阳性血清B1和D2（即双孔），其他被检血清安排见附录B。
3. 4.3  稀释好样品的细胞板置于4℃过夜。
4. 4.4  取出稀释样品板，不要冲洗。
5. 4.5  向各孔加入100 μL工作浓度生物素标记的TGEA位点单抗。
6. 4.6  用主要试剂时，每个样品在两块板中孵育，每块板应分开操作。使用不同的单克隆抗体，分开计算，并含有各自的阴、阳性血清。
7. 4.7  室温2 h或4℃过夜。
8. 4.8  用PBST洗三次。
9. 4.9  每孔加入100 μL工作浓度辣根过氧化物酶标记的亲和素，室温中培养30 min~45 min。
10. 4.10  PBST洗三次。
11. 4.11  每孔加入200 μL ABTS（见附录C）。
12. 4.12  室温30 min后加入100 μL 5%十二烷基硫酸钠（质量浓度）终止反应。