【国家标准】 氨基酸产品和添加剂预混合饲料中赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸含量的测定

ICS65.120
CCS B46
中华人民共和国国家标准
GB/T42957—2023
氨基酸产品和添加剂预混合饲料中赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸含量的测定Determination of lysine, methionine and threonine in commercialamino acid products and additivepremixture feeds(ISO 17180:2013, Animal feeding stuffs—Determination of lysine, methionineand threonine in commercial amino acid products and premixtures, MOD)2023-08-06发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2024-03-01实施
GB/T42957—2023
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件修改采用ISO17180：2013《动物饲料氨基酸产品和预混合饲料中赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸的测定》。
本文件与ISO17180：2013相比，在结构上有较多调整。两个文件之间的结构编号变化对照一览表见附录A。
本文件与ISO17180：2013的技术差异及其原因如下：a）更改了适用范围（见第1章，ISO17180：2013的第1章），以满足我国添加剂预混合饲料产品中赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸的检测需要；更改了对试验用水的要求（见5.1，ISO17180：2013的3.1），以符合我国国家标准对试验用水b）更
的规定；
增加了称量精度（见5.6、5.11、5.13、5.14、8.2.1、8.2.2、8.3.1、8.3.2)，以增加可操作性；c）
更改了溶解操作（见5.14、8.2.1、8.2.2、8.3.1、8.3.2,IS017180：2013的3.11.2、5.3.1、5.3.2、5.4.1、5.4.2），容量瓶不用于溶解，以增加规范性；e）增加了500mL的玻璃烧杯（见6.1），以增加可操作性；删除了500mL的容量瓶（见ISO17180：2013的4.2），以增加可操作性；f）
增加了分析天平的精度要求（见6.9），以增加可操作性；h)
更改了试样制备方法（见第7章，IS017180：2013的5.1），以增加可操作性；增加了赖氨酸硫酸盐及其发酵副产品的称样量范围（见8.2.1和8.3.1)，以满足我国饲料行业i）
赖氨酸硫酸盐及其发酵副产品的实际检测需要；删除了实验室间检验的内容（见ISO17180：2013的7.1），以适应我国的技术条件；j）
更改了精密度要求（见第10章，ISO17180：2013的7.2），以满足我国饲料行业实际检测k）
需要；
删除了再现性的内容（见ISO17180：2013的7.3），以适应我国的技术条件；m）删除了检测报告（见ISO17180：2013的第8章），以适应我国的技术条件。本文件做了下列编辑性改动：
a）为与现有标准协调，将标准名称更改为《氨基酸产品和添加剂预混合饲料中赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸含量的测定》；
更改了第1章的注中简称的使用范围；c)
增加了4种氨基酸标准品的CAS号；d）
更改了盐酸浓度表述；
删除了“仪器设备”一章的悬置段；增加了赖氨酸盐酸盐转换成赖氨酸的公式编号；f）
g）更改了附录A的内容；
h）增加了附录B(资料性)“氨基酸标准品的色谱图”。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)提出并归口。1
GB/T42957—2023
本文件起草单位：中国农业大学、全国畜牧总站。本文件主要起草人：贺平丽、谯仕彦、郑君杰、李竞前、尹刘益、张雅患、王春林、何志伟、杨苑、宋军、李瑶、迟超逸。
氨基酸产品和添加剂预混合饲料中赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸含量的测定GB/T42957-2023
警示一一本文件可能涉及一些危险材料的使用和设备操作。本文件并非旨在解决其使用时相关的安全风险。使用本文件前需要建立相应的安全健康规程并根据当地监管条例确定其适用性。1范围
本文件描述了氨基酸产品和添加剂预混合饲料中游离赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸含量的测定方法。本文件适用于饲料添加剂氨基酸、氨基酸硫酸盐和氨基酸盐酸盐、混合型饲料添加剂及添加剂预混合饲料中游离赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸含量的测定，不适用于饲料添加剂蛋氨酸羟基类似物、蛋氨酸羟基类似物钙盐，也不适用于饲料添加剂赖氨酸硫酸盐及其发酵副产物中结合赖氨酸含量的测定本文件不适用于区分单个氨基酸的D型和L型。本文件游离赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸的定量限为0.1%。注：为了表述方便，以下将使用“氨基酸”代替“游离赖氨酸、蛋氨酸和苏氮酸”。2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验空用水规格和试验方法GB/T20195动物饲料试样的制备
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。4原理
试样中的氨基酸经稀盐酸提取，柠檬酸钠缓冲溶液稀释，添加内标正亮氨酸，用氨基酸分析仪或高效液相色谱仪（HPLC)，阳离子交换色谱柱分离，柠檬酸钠缓冲溶液进行洗脱，通过三酮柱后衍生紫外分光光度检测器或邻苯二甲醛(OPA)柱后衍生荧光检测器对氨基酸进行测定。5试剂或材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.1水：GB/T6682，一级。
5.2赖氨酸盐酸盐标准品（CAS号：657-27-2）：纯度不低于99%，使用前放人盛有五氧化二磷的真空干燥器中干燥2d。
5.3苏氨酸标准品（CAS号：80-68-2）：纯度不低于99%，使用前放人盛有五氧化二磷的真空干燥器中1
GB/T42957—2023
干燥2d。
5.4蛋氨酸标准品（CAS号：63-68-3）：纯度不低于99%，使用前放人盛有五氧化二磷的真空干燥器中干燥2d。
5.5正亮氨酸标准品（CAS号：327-57-1)：作为内标，纯度不低于99%，使用前放人盛有五氧化二磷的真空干燥器中干燥2d。
5.6氢氧化钠溶液[c(NaOH)=7.5mol/L]：用于柠檬酸钠缓冲溶液pH的调节。用水（5.1)小心溶解300g（精确至1mg）氢氧化钠，并定容至1L。5.7盐酸，(HCI)=370g/kg。
5.8柠檬酸钠二水合物。
硫二甘醇。
5.10苯酚：纯度不低于98.5%
5.11柠檬酸钠缓冲溶液（pH=2.2)：将19.61g（精确至1mg）柠檬酸钠二水合物（5.8）、5mL硫二甘醇（5.9）、1g（精确至
0.1mg）苯酚（5.10）和16.5mL盐酸（5.7）用800mL水（5.1）溶解，用少量盐酸（5.7）或氢氧化钠溶液（5.6)调节pH至2.2。苯酚起保存缓冲溶液的作用柠檬酸钠缓冲溶液也能由柠檬酸和氯化钠制备。5.12盐酸溶液［（HCl）0.1mol/1量取82m盐酸（5.7）.加人约900mL水（5.1稀释，混合均匀.定容至1L。
后加水（5.
5.13正亮氨酸内标储备溶液2子mmol/L1用手m蓝酸12）溶解0.828g（精确至0.1mg）正亮氨酸（5.5），移至1工容量瓶后定容5.14氨基酸标准储备溶液
5℃保存有效期全月。
每种氨基胶分别制备标准储备溶液。标准溶液应仅包含
、苏氨酸或蛋氨酸。市售混合标准溶液，例如包含18种氨基酸的溶被分析白的氨基酸，即仅包金赖氮酸、液，无法提供最佳结果。
用0.）mol/L盐酸（5.分训盗解0.456g精确至0.1m赖氨酸益酸益标准品（5.2）0.297g（精确至0.1mg）苏酸标准品（3和037精确至容。低于5℃保存，有效期6个月5.15混合氨基酸标准工作溶液制备方法如下。蛋氮酸标准品后转移至1L容量瓶定a）称重稀释法：分别称量2.5mL各氨基酸标准储备溶液（5.14)的质量（m）及2.5mL正亮氨酸内标储备溶液（5.13)的质量（mNle），然后将各氨基酸标准储备溶液（5.14）分别与正亮氨酸内标储备溶液（513)转移至50mL容量瓶（6.2)中，用柠檬酸钠缓冲溶液（5.11)定容。低于5℃保存，有效期1周。
b）体积稀释法：用移液管（6.4)或稀释器（6.7)移取等体积的氨基酸标准储备溶液（5.14)和正亮氨酸内标储备溶液（5.13），用柠酸钠缓冲溶液（5.11)稀释。示例：移取50uL正亮氨酸内标储备溶液（5.13）和50μL氨基酸标准储备溶液（5.14），用柠檬酸钠缓冲溶液（5.11）稀释至1000μL。
5.16阳离子交换柱的洗脱缓冲液：购买市售缓冲溶液或根据仪器说明配制。通常使用3种5种含有柠檬酸钠或碳酸钠和少量添加剂和防腐剂的缓冲溶液。5.17节三酮或邻苯二甲醛（OPA）溶液：购买市售试剂或按照仪器说明书配制。6仪器设备
6.1玻璃烧杯：500mL、1000mL。6.2容量瓶：50mL、100mL、1000mL。6.3量筒：100mL、1000mL。
6.4移液管：5mL、10mL。
6.5磁力搅拌器或摇床。
6.6滤膜：0.22μm，醋酸纤维塑料/聚偏二氟乙烯。GB/T42957—2023
6.7稀释器：选择体积稀释法时用到。如果使用三酮进行衍生化，将试样溶液稀释20倍后衍生；通过OPA衍生时稀释倍数更高一些。定期用天平核查体积稀释的变异系数(CV)，CV不应超过1%。6.8pH计。
6.9分析天平：精度1mg、0.1mg。6.10氨基酸分析仪或等效的高效液相色谱仪：a）阳离子交换柱：置于柱温箱中；b）
保护柱；
自动或手动进样系统：进样量为10μL～100μL；c）
HPLC高压输液泵；
三酮或OPA柱后衍生泵；
采用节三酮柱后衍生时用紫外检测器检测：波长440nm和570nm；OPA柱后衍生时用荧光检测器检测：激发波长330nm，发射波长460nm；用于峰值积分的数据采集与处理系统。g)
7制备试样
按GB/T20195制备试样。取样品至少200g，粉碎，使其全部通过0.25mm孔径的分析筛，充分混匀。
8试验步骤
8.1试样准备
平行做两份试验。
8.2称重稀释法
饲料添加剂氨基酸、氨基酸盐
分别称取试样（0.45g~0.47g赖氨酸盐酸盐或0.65g~0.74g赖氨酸硫酸盐及其发酵副产品、0.29g~0.31g苏氨酸、0.36g~0.38g蛋氨酸）（精确至0.1mg）于500mL玻璃烧杯中（6.1），加人约400mL0.1mol/L盐酸溶液（5.12）。用磁力搅拌器（6.5）搅拌30min溶解试样，称量提取液的总质量（mex）（精确至1mg）。用刻度移液管（6.4）移取并称量1mL提取液（mai）置于50mL容量瓶（6.2）中（精确至0.1mg），随后移取并称量2.5mL正亮氨酸内标储备溶液（5.13）（mNle）加人该容量瓶（6.2）（精确至0.1mg），最后用柠檬酸钠缓冲溶液（5.11)定容并混合均匀。如果试样不在当天上机检测，则应在5℃以下存放不超过1周。8.2.2添加剂预混合饲料或混合型饲料添加剂氨基酸产品通过预测试样中氨基酸含量的最低值，按公式（1）计算出大致的试样称样量mtppremix，单位为克(g)：
mtppremix
m tp pureX100
......(1)
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式中：
mtppureaa
用于饲料添加剂氨基酸、氨基酸盐检测的试样称样量，单位为克（g)；预测试样中所含氨基酸的最低质量分数，单位为克每百克（g/100g）。以蛋氨酸为例，用于饲料添加剂蛋氨酸检测的称样量为0.36g～0.38g，因此，对于含有20%质量分数的蛋氨酸添加剂预混合饲料样品，根据公式（1)计算出的试样称样量为1.8g～1.9g。根据试样称样量的计算结果称取样品，并将称量好的试样置于500mL玻璃烧杯（6.1)中（精确至0.1mg）。加入约400mL0.1mol/L盐酸溶液（5.12）。用磁力搅拌器（6.5）搅拌30min溶解试样，称量提取液的总质量（mex）（精确至1mg）。移取并称量1mL（精确至0.1mg）提取液（mai）于50mL容量瓶（6.2）中，随后移取并称量2.5mL（精确至0.1mg）正亮氨酸内标储备溶液（5.13）（mNl）加入该容量瓶（6.2)，最后用柠檬酸钠缓冲液（5.11)定容并混合均匀。如果试样中氨基酸含量较高，可采用不超过1mL的提取物溶液加25mL正亮氨酸内标储备溶液（5.13)的方法稀释。
如果试样不在当天上机检测，则应在5℃以下存放不超过3d。8.3体积稀释法
饲料添加剂氨基酸、氨基酸盐
分别称取试样（0.45g04颗氨酸蓝酸盟或06g赖氨酸硫酸盐及其发酵副产品、0.29g~0.31g苏氨酸0.36038蛋氨酸精确至0.1m手00玻璃烧杯中（6.1），加人0.1mo1/L盐酸溶液（1磁力搅升器（6.5）搅摄30ml用/的容量瓶（6.2）定容并混合均900mL
匀。按照5.15b)标准溶液的配制过程进行试样稀释并加人正亮氨酸内标储备溶液（5.13）如果试样不在当天上机检测则应在王以下存放不超过3d
添加剂预混合饲料或混合型饲料添加剂氨基酸产品8.3.2
根据8.2.2描述的通过预测试样重复基酸含重的最低值（算试样的近似称样量m#premix，以克（g）为单位确保试样提取液中所测氮基酸的峰面积都在标准曲线的线性范国内。安照计算结果称取样品于1000mL玻璃烧杯（6.1)中（精确至0.1mg），加人900mL0.1mol/盐酸溶液（5.12)，磁力搅拌器（6.5)搅拌30mm.用1L的容量瓶（6.2)定容并混合均匀。按照5.15b)标准溶液的配制过程进行试样稀释并加入正亮氨酸内标储备溶液（5.13）。如果预混料中含有其他氨基酸浓度较高，则可采用不超过1ml的提取物加2.5mL正亮氨酸内标储备溶液（5.13)的方法稀释。
如果试样不能在当天上机检测，则应在5℃下保存不超过3d。8.4色谱测定
将适量待测溶液过0.22μm滤膜（6.6），装入进样小瓶中，并注人氨基酸分析仪或高效液相色谱仪(6.10)中。进样量一般为20μL～50μL。利用带保护柱的阳离子交换色谱柱进行分离，色谱分离体系应将氨基酸和其他成分（如氨、胺、肽或氨基糖）进行有效分离，混合标准溶液色谱图见附录B。为了避免因峰重叠而产生的错误结果，所分析的氨基酸色谱峰基线应与其他被洗脱的杂质色谱峰基线实现100%分离。色谱峰面积应与标准曲线的浓度呈现良好的线性关系。4
试验数据处理
9.1方法校准控制
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用标准溶液（5.15)计算试样中每种氨基酸的含量。为监测测定结果是否漂移，每进4针后插入标准溶液作为质量控制。如果这些质控试样的回收率在99%～101%之外，重复分析试样。通过积分确定标准溶液和试样中待测氨基酸峰的峰面积，并按9.2或9.3计算试样中氨基酸的质量分数。
称重稀释法数据处理
按公式（2)计算每种氨基酸的响应因子（FRa）：ANleeXman
AaeXmNle
式中：
ANltee
标准溶液中正亮氨酸的峰面积
氨基酸储备溶液的质量单位为克标准容液中待测复基酸的峰面秘mL正亮氨酸础益流液商质量，巢位为克（g）。2.5
试样中氨基酸的含量以其质质分数w（Aaa ts
式中：
Aaa ts
mNlets
ANlets
试样溶液中待测经基酸的峰面积；待测氨基酸的响应因有
，按公
3)计算
letsXm免费标准下载网bzxz
mp×10
......
.........
（2）
....（3)
储备溶液中得测氮基酸的质重分数单位为克每下克（g/1000g），假定1溶液的质量1000
2.5mL正亮氨酸在试样溶液中的质量，单位为克（g）；总提取液的质量，单位为克(g)；试样溶液中正亮氨酸的峰面积；试样的质量，单位为克（g），
稀释提取液的质量，单位为克（g)。体积稀释法数据处理
按公式（4)计算氨基酸的响应因子（FRa）：FRa
式中：
标准溶液中正亮氨酸的峰面积：标准溶液中待测氨基酸的峰面积。Anlee
试样中氨基酸的含量以其质量分数w（%)计，按公式(5)计算：A×FRa×m×100
ANletsXmtp
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式中：
ANle ts
试样溶液中待测氨基酸的峰面积；待测氨基酸的响应因子；
氨基酸在储备溶液中的质量浓度，单位为克每升(g/L)；试样溶液中正亮氨酸的峰面积；试样的质量，单位为克（g）。
注：计算结果以“原样”表示。根据含量计算规则，如氨基酸含量以干物质计，则检测样品的干物质；如果产品直接分析，计算结果即以原样计。
赖氨酸盐酸盐的结果能通过公式(6)转换成赖氨酸：WLys =WLys-Hc/1.25
式中：
WLys·HCI
精密度
赖氨酸的质量分数，%；
赖氨酸盐酸盐的质量分数，%。
两份平行试样分析结果。按公式(7)计算相对差值，结果以%表示：[Waal -Wan2 |
Wl+Wm2
式中：
第一个检测值；
第二个检测值；
Wl—Waa2|——两次检测结果之间的绝对差值。（6）
·（7）
对于氨基酸含量大于或等于10%的样品，如果D值小于或等于1.5%，则选择平均值作为最终结果。如果D值大于1.5，则提取第三个样本进行检测，并计算这三次测定的平均值，如果CV小于或等于3%，选择三个测定值的平均值作为最终结果；如果CV大于3%，则将样品混匀后再次进行分析。对于氨基酸含量小于10%的样品，如果D值小于或等于2.5%，则选择平均值作为最终结果。如果差异更大，则提取第三个样本进行检测，并计算这三次测定的平均值，如果CV小于或等于5%，选择三个测定值的平均值作为最终结果，如果CV大于5%，则将样品混匀后再次进行分析。6
附录A
（资料性）
本文件与ISO17180：2013结构编号对照一览表本文件与ISO17180：2013结构编号对照情况见表A.1。本文件与ISO17180：2013结构编号对照情况表A.1
本文件结构编号
GB/T42957—2023
ISO17180：2013结构编号
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表A.1本文件与IS017180：2013结构编号对照情况（续）本文件结构编号
附录 A
附录 B
ISO17180：2013结构编号
7.1、7.3、8、附录A、参考文献
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