【国家标准】 食品安全国家标准 食品微生物学检验 创伤弧菌检验

中华人民共和国国家标准
GB4789.44—2020
食品安全国家标准
食品微生物学检验
2020-09-11发布
创伤弧菌检验
2021-03-11实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局
1范围
食品安全国家标准
食品微生物学检验
创伤弧菌检验
本标准规定了水产品中创伤弧菌（Vibriouulnificus）的检验方法本标准适用于鱼、虾、蟹、贝类等水产品中创伤弧菌的检验。2
设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱：36℃士1℃。
2冰箱：2℃~5℃7℃~10℃。
3恒温水浴锅。
2.4均质器或无菌研钵。
天平：感量0.1g。
PCR仪。
电泳仪或毛细管电泳仪，
凝胶电泳成像系统或紫外检测仪生物安全柜。
高速离心机（最大转速至少15000r/min）。涡旋振荡器。
微量可调移液器（量程2.5L、10L、100μL、1000μ)及配套吸头。精密pH试纸或pH计。
无菌试管：规格18mm×180mm和15mm×100mm。无菌吸管：规格1mL（具0.0lmL刻度）和10mL（具0.1mL刻度）。无菌锥形瓶：容量250mL，500mL和1000mL。无菌培养Ⅲl：直径90mm。
无菌手术剪、镊子、钳子等。
PCR反应管。
培养基和试剂
蛋白陈-氯化钠-纤维二糖-多黏菌素E(PNCC)增菌液：见A.1。3.2纤维二糖-多黏菌素E(CC)琼脂培养基：见A.2。3.3改良纤维二糖-多黏菌素B-多黏菌素E(mCPC)琼脂培养基：见A.3。3.43%氯化钠胰蛋白陈大豆琼脂培养基：见A.4。3.5
5磷酸盐缓冲液（PBS）：见A.5。3.6
53%氯化钠三糖铁琼脂斜面：见A.6。GB4789.44—2020
3.7嗜盐性试验培养基：见A.7。3.83%氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基：见A.8。3%氯化钠MR-VP培养基：见A.9。3.9
3%氯化钠溶液：见A.10。
氧化酶试剂：见A.11。
革兰氏染色液：见A.12。
邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG)试剂：见A.13。Voges-Proskauer(V-P)试剂：见A.14。细菌DNA提取试剂盒。
生化鉴定试剂盒。
PCR反应配套试剂。
琼脂糖凝胶电泳配套试剂。
具有菌种保藏资质单位提供的创伤弧菌标准菌株。检验程序
创伤弧菌检验程序见图1。
样品25g(mL)+225mLPNCC增菌液
36℃±1℃,18h±1h
36℃±1℃,18h±1h
PCR检测
划线接种于CC平板和mCPC平板
36C±1,18h±1h
挑取可疑菌落，接种于3%氧化钠胰蛋白陈大豆琼脂平板36±1C,18h±1h
初步鉴定：包括革兰氏染色、氧化酶试验、三糖铁试验，嗜盐性试验
生化试验
结果与报告
创伤弧菌检验程序
PCR鉴定
PCR分型(选做）
GB4789.44-2020
5操作步骤
5.1样品制备
GB4789.44-—2020
5.1.1新鲜样品采集后应于3h内完成检验，若不能在规定时间内完成，则将样品置于7℃～10℃条件下保存（因创伤弧菌在4℃条件下极易形成活而不可培养的状态，因此样品勿放4℃条件下），并尽可能在24h内完成检验；冷冻样品应在不超过45℃的温热条件下解冻，解冻时间不超过15min。5.1.2取样：鱼类和头足类取其表面组织、肠和鳃。贝类则取全部内容物（包括贝肉和体液）。甲壳类取整个动物或其中心部分（包括肠和鳃）。如为带壳贝类或硬壳甲壳类，则应先用流动自来水冲洗外壳并用滤纸吸干表面水分然后无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。5.1.3以无菌操作取上述处理后的样品25g加入PNCC增菌液225mL，用旋转刀片式均质器以8.000r/min均质1min，或用拍击式均质器均质2min，充分混匀制备成1：10的样品匀液。如无均质器，则将样品放人无菌乳钵中充分研磨，取磨碎后的样品25g转人500mL无菌锥形瓶中，加PNCC增菌液225mL，充分振荡混匀，制备成1：10的样品匀液。5.2增菌
将5.1.3制备的1：10样品匀液于36℃土1℃培养18h士1h。5.3PCR检测
食品分子生物学检
PCR实验环境条件和过程控制应参照GB/T27403《实验室质量控制规范测》规定执行，下同。
5.3.1DNA模板的制备
在距离PNCC增菌液的液面下1cm处吸取1mL置于1.5mLEP管中.90o0r/min离心3min弃去上清液。向沉淀中加人1mLPBS将其悬浮并充分清洗后，9000r/min离心3min，弃去上清液，按此步骤反复清洗沉淀2次～3次，弃去最后一遍上清液，加人1mL无菌超纯水，100℃煮沸10min，继而12000r/min离心5min，上清液用于PCR分析。若不能及时分析则于一20℃保存备用。也可以用商品化的DNA提取试剂盒按其说明书要求提取制备DNA模板。5.3.2PCR扩增
5.3.2.1引物
信息见表1。
表1创伤弧菌PCR检测用引物信息引物
vuhA-785F
uhA-1303R
对照设置
5CCGCGGTACAGGTTGGCGCA3
5'CGCCACCCACTTTCGGGCC3
扩增片段长度/bp
每次PCR反应使用创伤弧菌标准菌株作为阳性对照同时，使用除创伤弧菌之外的其他弧菌的标准菌株作为阴性对照，以灭菌去离子水作为空白对照。3
PCR反应体系
见表2。
表2创伤弧菌PCR检测反应体系组成无菌超纯水
10XPCR缓冲液
25mmol/LMgCl
2.5mmol/LdNTP
上游引物（10μmol/L）
上游引物（10μmol/L）
DNA模板
5U/μLTaq酶
总体积
PCR反应程序
反应体积/μL
GB4789.44—2020
预变性：94℃、5min；变性：94℃、1min；退火：62℃、1min；延伸：72℃、1min；循环数：30；终延伸：72℃、10min；电泳检测。若不能立即检测则4℃保存备用。5.3.3
凝胶电泳检测PCR扩增产物。用0.5×TBE缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶（含EB0.5ug/mL或Goldview5μL/100mL或Gelred5μL/50mL等DNA染料），取5μLPCR扩增产物与1μL6×核酸电泳上样缓冲液混合后·点样，同时有一孔加入DNA分子量标准（范围为100bp～1000bp）。根据以下公式：电泳槽正负极的距离（cm）×5V/cm计算并设置电压，使用0.5×TBE缓冲液恒压电泳，根据溴酚蓝的移动位置确定电泳时间，使用凝胶成像系统或紫外检测仪观察和记录结果。5.3.4结果判定
质控系统：阴性对照和空白对照均未出现扩增条带，阳性对照出现预期大小（519bp）的扩增条带，则检测系统正常。否则，任一种对照如果出现非上述正常结果，应重做实验，同时排除污染因素。阳性结果：在质控系统正常的情况下，待测样品出现预期大小（519bp）的扩增条带，判定PCR结果为阳性。
阴性结果：在质控系统正常的情况下，待测样品未出现预期大小（519bp）的扩增条带，判定PCR结果为阴性。
5.4分离
用10aL接种环在距离PNCC增菌液的液面下1cm沾取一环增菌液，分别划线接种于CC和mCPC平板，于36℃土1℃条件下培养18h士1h。典型的创伤弧菌在CC和mCPC平板上的形态为圆形、扁平，光照下呈透明或中心不透明但边缘透明的黄色至橘黄色菌落，菌落直径1mm～2mm.菌落周围可出现（或不出现)黄色晕圈。5.5分纯培养
GB4789.44—2020
从CC平板和mCPC平板上各挑取至少5个创伤弧菌可疑菌落（少于5个时全选），分别接种于3%氯化钠胰蛋白陈大豆琼脂平板，36℃士1℃培养18h士1h后用于后续鉴定。创伤弧菌在3%氯化钠胰蛋白陈大豆琼脂平板上的菌落形态为圆形、乳白色、湿润、隆起、直径1mm2mm。5.6鉴定
创伤弧菌可采用菌落特征结合生化特性或PCR方法进行鉴定。5.6.1菌落特征及生化特性
5.6.1.1初步鉴定
该步骤用于创伤弧菌的初步鉴定，进行以下4项鉴定实验时，挑取的菌落应来自分纯后的同一个单菌落。
革兰氏染色镜检：从5.5中3%氯化钠胰蛋白陈大豆琼脂平板上挑取创伤弧菌疑似菌落进行革a）
兰氏染色并镜检。创伤弧菌为革兰氏阴性，显微镜下菌体为棒状、弧状、卵圆状等多种形态，无芽胞。
氧化酶试验：用接种环从5.5中3%氯化钠胰蛋白陈大豆琼脂平板上挑取创伤弧菌疑似菌落适量，涂布在用氧化酶试剂润湿（如无菌滤纸）或滴有氧化酶试剂的白色或无色载体上（如载玻片）。如果涂菌部位在10s之内变紫色（偶有蓝紫色），即为氧化酶试验阳性，不变色为氧化酶试验阴性。创伤弧菌为氧化酶试验阳性。三糖铁试验：用接种针从5.5中3%氯化钠胰蛋白陈大豆琼脂平板上挑取创伤弧菌疑似菌落适c)
量，转种于3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层（注意接种针不要触及试管底部），36C土1℃培养24h观察结果。创伤弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂斜面中生长时试管底层变黄，无气泡，斜面颜色不变黄（偶有斜面颜色变黄现象）。d）嗜盐性试验：用接种针从5.5中3%氯化钠胰蛋白陈大豆琼脂平板上挑取创伤弧菌疑似菌落，分别接种于含0%、3%、6%、8%和10%氯化钠的胰蛋白陈水中，36℃土1℃培养24h，观察液体的混浊情况。创伤弧菌在含0%、8%和10%氯化钠的胰蛋白陈水中不生长或微弱生长，胰蛋白陈水澄清透亮或稍混浊，面在含3%和6%氯化钠的胰蛋白陈水中生长旺盛，胰蛋白陈水混浊。
确证实验
将初步鉴定为创伤弧菌的疑似菌落接种在3%氯化钠胰蛋白陈大豆琼脂平板上，36℃土1℃培养18h士1h后，取纯培养物分别接种于含3%氯化钠的赖氨酸脱羧酶试验培养基和MR-VP培养基中，36℃土1℃培养24h～48h后观察结果：另取少许纯培养物接种于3%氯化钠三糖铁琼脂斜面，36℃士1℃培养18h后用于ONPG试验。也可选择生化鉴定试剂盒进行鉴定。创伤弧菌生化特性见表3，与其他弧菌的鉴别见表4。表3创伤弧菌生化特性
试验项目
革兰氏染色镜检
氧化酶
阴性，无芽胞
表3（续）
试验项目
GB4789.44—2020
D-纤维二糖
分解葡萄糖产气
葡葡糖
创伤弧菌主要生化特性与其他弧菌的比较鉴别D
表示多数阳性
嗜盐性试验
NaCI含量/%
颗氨酸脱羧酶
注：十表示阳性：一表示阴性；十/一硫化氢
V.parahaemolyticus
V.vulnificus
创伤弧菌
副溶血性弧菌
表示多数阳性：V表示可变
注：十表示阳性，一表示阴性：十/-V.alginolyticus
溶藻弧菌
霍乱弧菌
V.cholerae
拟态弧菌
V.mimicus
V.fluvialis
河弧菌
弗氏弧菌
V.furnissi
V.metschnikovii
梅氏弧菌
5.6.2PCR鉴定
本部分试验可替代5.6.1用于创伤弧菌的快速鉴定。5.6.2.1DNA模板的制备
GB4789.44—2020
从5.5中3%氯化钠胰蛋白陈大豆琼脂平板上挑取创伤弧菌疑似菌落，转至500L无菌超纯水中，充分混匀后制成肉眼可见的混浊菌悬液，煮沸10min，12000r/min离心5min，取上清液用于PCR分析。若不能及时分析则于一20℃保存备用。也可以用商业化的DNA提取试剂盒按其说明提取制备DNA模板。PCR扩增和电泳
同5.3.2和5.3.3。
结果判定
质控系统：阴性对照和空白对照均未出现扩增条带，阳性对照出现预期大小（519bp）的扩增条带，则检测系统正常。否则，任一种对照如果出现非上述正常结果，应重做实验，同时排除污染因素。阳性结果：在质控系统正常的情况下，待测样品出现预期大小（519bp）的扩增条带，判定PCR结果为阳性，该菌株是创伤弧菌。
阴性结果：在质控系统正常的情况下，待测样品未出现预期大小（519bp）的扩增条带，判定PCR结果为阴性，该菌株不是创伤弧菌。5.7
创伤弧菌分型（选做）
5.7.1DNA模板的制备
取鉴定结果为创伤弧菌的菌株制备DNA模板，制备方法同5.6.2.1。5.7.2
PCR扩增
PCR分型用引物信息见表5。
表5创伤弧菌PCR分型用引物信息目的基因
16SrRNAA
16SrRNAB
引物序列
F:5'AGC TGC CGA TAG CGA TCT 3R:5'TGAGCTAACGCGAGTAGTGAG3
F:5'CTCAGAAAGGCTCAATTGAC3
R:5GATTAACGCTGTAAGGCCG3
F:5'CATGATAGCTTCGGCTCAA3
R:5'CACTACCACCTT CCT CAC GAC3F:5°GCCTACGGGCCAAAGAGG3
R.5CCTGCGTCTCCGCTGGCT3
片段长度/bp
毒力相关基因ucg分型
16SrRNA基因分型
目的基因
：对照设置
表5（续）
引物序列
F:5TGTTGTTCTTGCCCACTCTC3
R:5CGCGCTTAGATTTCTCTCACC3
F:5AGA GAT GGA AGA AAC AGG CG 3R:5GGACAGATATAAGGGCAAATGG3
片段长度/bp
GB4789.44—2020
血清E型和生物
Ⅱ型检测
每次PCR反应使用含有目的基因的创伤弧菌标准菌株作为阳性对照，同时，使用除创伤弧菌之外的其他革兰氏阴性菌标准菌株作为阴性对照，以灭菌去离子水作为空白对照。5.7.2.3
PCR反应体系
同表2。
5.7.2.4PCR反应程序
预变性：94℃、5min；变性：94℃、1min；退火：55℃（cg基因）、58℃（16SrRNA基因）、64℃（Bt2基因及SerE基因）1min延伸：72℃、1min循环数：30个循环（ucg基因及16SrRNA基因）、35个循环（Bt2基因及SerE基因）；终延伸：72℃、5min；电泳。若不能及时电泳检测，则将扩增产物于4℃短期(1d～2d)储存。
5.7.3电泳
同5.3.3。
5.7.4结果判定
质控系统：阴性对照和空白对照均未出现扩增条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带，则检测系统正常。否则，任一种对照如果出现非上述正常结果，应重做实验，同时排除污染因素。在质控系统正常的情况下，如果待测菌株出现97bp大小的条带，则判定该株创伤弧菌为ucgC型；如果出现199bp大小的条带，则判定该株创伤弧菌为ucgE型；如果待测菌株出现285bp大小的条带，则判定该株创伤弧菌为16SrRNAA型，如果出现839bp大小的条带，则判定该株创伤弧菌为16SrRNAB型，如果同时出现285bp大小和839bp大小的两条带，则判定该株创伤弧菌为16SrRNAA/B型；如果待测菌株出现665bp大小的条带，则判定该株创伤弧菌为血清E型；如果待测菌株出现344bp大小的条带，则判定该株创伤弧菌为生物Ⅱ型。结果与报告
根据菌落特征、生化特性或PCR鉴定结果，报告25g样品中检出或未检出创伤弧菌8
培养基和试剂
A.1蛋白陈-氯化钠-纤维二糖-多黏菌素E(PNCC)增菌液A.1.1
溶液1
蛋白陈
氯化钠
蒸馏水
GB4789.44—2020
将A.1.1.1各成分溶于蒸馏水中，用1mol/L盐酸溶液和1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至8.5±0.2.121℃高压灭菌10min。www.bzxz.net
溶液2
纤维二糖
多黏菌素E
蒸馏水
A.1.2.2制法
将纤维二糖溶于蒸馏水中，轻微加热至完全溶解，冷却后加入抗菌素，用0.22um微孔滤膜过滤除菌后备用。
将溶液1与溶液2混合即为PNCC增菌液。A.2
纤维二糖-多黏菌素E(CC)琼脂培养基A.2.1
溶液1
蛋白陈
牛肉粉
氯化钠
溴麝香草酚蓝
甲酚红
蒸馏水
A.2.1.2制法
GB4789.44—2020
将A.2.1.1中的各种成分溶于蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解后，用1mol/L盐酸溶液和1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.6士0.2.冷却至48℃～55℃备用。2溶液2
A.2.2.1成分
纤维二糖
多黏菌素E
蒸馏水
A.2.2.2制法
400000U
将纤维二糖溶于100.0mL蒸馏水中，轻微加热至完全溶解，冷却后加人抗菌素，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后备用。
将溶液2与溶液1混合后倾注平板改良纤维二糖-多黏菌素B-多黏菌素E(mCPC)琼脂培养基A.3
溶液1
A.3.1.1成分
蛋白陈
牛肉粉
氯化钠
溴麝香草酚蓝
甲酚红
蒸馏水
A.3.1.2制法
将A.3.1.1中的各种成分溶于蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解后，用1mol/L盐酸溶液和1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.6士0.2.冷却至48℃~55℃备用。A.3.2
溶液2
纤维二糖
多黏菌素 B
多黏菌素E
蒸馏水
100000U
400000U
A.3.2.2制法
GB4789.44—2020
将纤维二糖溶于100.0mL蒸馏水中，轻微加热至完全溶解，冷却后加人抗菌素，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后备用。
将溶液2与溶液1混合后倾注平板A.4
3%氯化钠胰蛋白陈大豆琼脂
胰蛋白陈
大豆蛋白陈
氯化钠
蒸馏水
2制法
将A.3.1中的各种成分溶于蒸馏水中，用1mol/L盐酸溶液和1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.3士0.2,121℃高压灭菌15min。A.5
磷酸盐缓冲液(PBS)
磷酸二氢钾（KHPO,）
蒸馏水
贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500.0mL蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠溶液（约175mL）调节pH至7.2，用蒸馏水稀释至1000.0mL后于冰箱贮存备用。稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000.0mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。
3%氯化钠三糖铁琼脂斜面
蛋白陈
胰蛋白陈
牛肉粉
酵母粉
氯化钠
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