【国家标准】 食品安全国家标准 食品中维生素K2的测定

中华人民共和国国家标准
GB5009.2902023
食品安全国家标准
食品中维生素K2
2023-09-06发布
的测定
2024-03-06实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局
1范围
食品安全国家标准
食品中维生素K2
的测定
GB5009.2902023
本标准规定了食品中四烯甲萘醒、七烯甲萘醒、九烯甲萘醒含量的液相色谱测定方法。本标准适用手乳及乳制品、特殊膳食用食品、发酵豆制品和肉及肉制品中四烯甲醒、七烯甲配、九烯甲茶醒三种维生素K2
分型的测定
2原理
试样经脂肪酶、淀粉酶或蛋白酶酶解，采用正已烷提取四烯甲萘醒、七烯甲萘醒、九烯甲萘醒，提取液浓缩后经反相液相色谱分离，锌还原柱柱后衍生，荧光检测器检测，外标法定量。3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂
甲醇(CHOH):
色谱纯。
无水乙醇(C2HO)。
正已烷(C。H，4)。
碳酸钾(K2CO3)。
二氯甲烷(CH2Cl2):
四氢呋喃(C4HO)：
冰乙酸(C2H。O2)。
氯化锌(ZnCl2)。
色谱纯。
色谱纯。
无水乙酸钠(C2HsO2Na)。
磷酸二氢钾(KHz PO。)。
淀粉酶：(CAS号：9000-92-4)酶活力≥4000U/g。脂肪酶：(CAS号：9001-62-1)酶活力≥40U/g蛋白酶：(CAS号：9001-73-4)酶活力≥6000U/mg氢氧化钾(KOH)。
3.2试剂配制
g/L氢氧化钾溶液：称取20.0g氢氧化钾于100mL烧杯中，用20mL水溶解，冷却后，转移至50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，储存于聚乙烯瓶中。3.2.2
磷酸盐缓冲溶液(pH
18.0)：称取54.0g磷酸二氢钾于500mL烧杯中，用300mL水溶解，用g/L氢氧化钾溶液（3.2.1)调节pH至8.0土0.2，转移至500mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀。400
GB5009.2902023
3.2.3流动相：称取1.5g氯化锌、0.5g无水乙酸钠于1000mL烧杯中，加入500mL甲醇、100mL三氯甲烷（或四氢）、0.3mL冰醋酸，转移至1000mL容量瓶中，超声溶解后，加甲醇定容至刻度，混匀，用0.22μm滤膜过滤
注：增加二氯甲烷，可以缩短保留时间，最高不宜超过150mLL3.2.4二氯甲烷甲醇溶液（体积比10+90）：准确吸取二氯甲烷20mL于200mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，混匀。
3.3标准品
3.3.1四烯甲萘醒(MK-4)标准品
(C31H40O2,CAS准物质证书的标准物质3.3.2七烯甲萘醒(MK-7）标准品(C46H4O2CAS标准物质证书的标准物质3.3.3九烯甲茶醒（MK-9）标准品(CseHO2,CAS准物质证书的标准物质。3.4标准溶液配制
3.4.1标准储备溶液
号：863-61-6：纯度≥98%，或经国家认证并授予标号：2124-57-4)：纯度≥98%，或经国家认证并授予号：523-39-7)：纯度≥98%，或经国家认证并授予标3.4.1.1
MK-4标准储备溶液（1.0mg/mL）：准确称取MK-4标准品25mg（精确至0.1mg），用二氯甲烷甲醇溶液（3.2.4）溶解并定容至25mL，混匀。将溶液储存于棕色玻璃容器中，-20℃土2℃避光保存，保存期限为6个月。
3.4.1.2MK-7标准储备溶液（1.0mg/mL）：准确称取MK-7标准品25mg（精确至0.1mg），用二氯甲烷甲醇溶液（3.2.4）溶解并定容至25mL，混匀。将溶液储存于棕色玻璃容器中，-20℃土2℃避光保存，保存期限为6个月。
3.4.1.3MK-9标准储备溶液（0.5mg/mL）：准确称取MK-9标准品25mg（精确至0.1mg），用二氯甲烷甲醇溶液（3.2.4)溶解并定容至50mL，混匀。将溶液储存于棕色玻璃容器中，-20℃土2℃避光保存，保存期限为6个月。
3.4.2标准中间溶液
MK-4和MK-7混合标准中间溶液（10μg/mL)：分别准确吸取MK-4、MK-7标准储备溶液3.4.2.1
0.50mL于50mL容量瓶中，用二氯甲烧甲醇溶液（3.2.4）稀释并定容至刻度，混匀。将溶液储存于棕色玻璃容器中，-20℃土2℃避光保存，保存期限为6个月。3.4.2.2MK-9标准中间溶液（50μg/mL）：准确吸取MK-9标准储备溶液5.00mL于50mL容量瓶中，用二氯甲烷甲醇溶液（3.2.4)稀释并定容至刻度，混匀。将溶液储存于棕色玻璃容器中，-20℃土2℃避光保存，保存期限为6个月。
3.4.3标准工作溶液
分别准确吸取MK-4、MK-7混合标准中间溶液0.025mL0.050mL、0.10mL、0.30mL、0.50mL、1.0mL于10mL容量瓶中，准确吸取MK-9标准中间溶液0.010mL、0.020mL、0.040mL、0.060mL、0.10mL、0.20mL于上述10mL容量瓶中，用流动相（3.2.3)定容至刻度，混匀。得到MK-4、MK-7标准工作溶液质量浓度分别为0.025μg/mL、0.050μg/mL、0.10μg/mL、0.30μg/mL、0.50μg/mL、2
1.0μg/mL,M-9
标准工作溶液质量浓度分别为0.050μg/mL、0.10μg/mL、0.20ug/mL、0.30μg/mL、0.50μg/mL、1.0μg/mL。临用现配。GB5009.2902023
注：MK-7、MK-9低温高浓度时易过饱和，出现浑浊，可提高溶解温度至40℃土2℃超声，至完全溶解，恢复室温使用：所称取的标准品质量是折合纯标准品的质量。3.5、材料
一次性微孔滤膜：0.22μm，有机相。4仪器和设备
4.1液相色谱仪：配有荧光检测器。4.2电子天平：感量分别为0.1g、1mg和0.01mg4.3水平振荡器。
4.4涡旋混合器。
5高速离心机（转速≥6000r/min）。4.5
6恒温水浴锅。
旋转蒸发仪。
3氮气浓缩装置。
pH计：精确至0.1。
组织粉碎机。
4.11均浆器。
超声波清洗器。
分析步骤
5.1：试样制备
质地均匀的粉末类样品测定前充分混匀：肉与肉制品取可食部分粉碎均质：其他固体、半固体样品粉碎均质。液态样品测定前混匀。注：处理过程尽可能避光操作，制备成均匀试样后，避光尽快检测。5.2试样处理
警示：处理过程应避免紫外光直接照射，尽可能避光操作。5.2.1酶解
5.2.1.1乳及乳制品和特殊膳食用食品称取混匀后的粉末试样50g（精确至0.1g)（m）至250mL烧杯中，加入100mL水，记录加水后的溶液质量（m2），充分混匀溶解：准确称取制备后的溶液6g（精确至0.001g)（ms）于50mL离心管中，加入水11mL，再加入磷酸盐缓冲液（3.2.2）5mL，混匀，于50℃土2℃水浴超声15min，冷却至室温后，加入脂肪酶0.5g，再加淀粉酶0.2g，加盖，涡旋2min~33min，混匀后，置于37℃±2℃
恒温水浴锅中酶解2h以上（每30min涡旋1min），使其充分酶解。液体样品，称取混匀样品1g~10g（精确至0.001g)（ms）于50mL离心管中，加水至15mL；提取液加入磷酸盐缓冲液（3.2.2）5mL，混匀，于50℃土2℃水浴超声15min，冷却至室温后，加入脂肪酶0.5g，再加淀粉酶0.2g，加盖，涡旋2min-3min,混匀后，置于37℃土2℃恒温水浴锅中酶解2h以上（每30min涡旋1min），使其充分酶解。3
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5.2.1.2发酵豆制品
称取均质后的试样50g（精确至0.1g)m）至250mL烧杯中，加入100mL水，记录加水后的溶液质量（m2），匀浆器匀浆后，立即准确称取匀浆试样3g（精确至0.001g)(m3）于50mL离心管中，加入水13mL，加入磷酸盐缓冲液（3.2.2）5mL，混匀，于50℃土2℃水浴超声15min，冷却至室温后，加入脂肪酶0.2g，加入蛋白酶0.1g，加盖，涡旋2min~3min，混匀后，置于37℃土2℃恒温水浴锅中酶解4h以上（每30min涡旋1min)，使其充分酶解。5.2.1.3肉及肉制品
称取均质后的试样50g（精确至0.1g)（m）至250mL烧杯中，加入100mL水，记录加水后的溶液质量（m2），匀浆器匀浆后，立即准确称取匀浆试样15g（精确至0.001g）m3）于50mL离心管中，加入水5mL，加入磷酸盐缓冲液（3.2.2)5mL，混匀，于50℃土2℃水浴超声15min，冷却至室温后，加入脂肪酶0.2g，加入蛋白酶0.1g，加盖，涡旋2min~33min，混匀后，置于37℃±2℃恒温水浴锅中酶解4h以上（每30min涡旋1min)，使其充分酶解。5.2.2提取
取出酶解好的试样，分别加入10mL无水乙醇及1.0g碳酸钾，混匀后加入10mL正已烷，3000r/min涡旋2min~3min或≥250r/min振荡提取10min，以6000r/min离心5min，转移上清液至100mL旋蒸瓶中。
注：为保证提取完全，必要时可向下层溶液中再加入10mL正已烷，重复操作1次，合并上清液至上述旋蒸瓶中5.2.3浓缩
将上述正已烷提取液于40℃土2℃水浴旋蒸至干（如有残液，可用氮气轻吹至干），用5.0mL流动相（3.2.3)充分溶解浓缩物，将此溶解液用0.22μm滤膜过滤，此滤液为制备的试样溶液。注：浓缩氮吹后，如果样品浓缩物常温不易溶解，可提高溶解温度至40℃土2℃，至完全溶解。纳豆等MK-7含量高的样品，可适当加大(5.23)定容体积，使制备的试样溶液浓度在标准曲线范围内。5.3仪器参考条件
5.3.1色谱柱：C，8(5μm,4.6mm×150mm)或具有同等性能的色谱柱。5.3.2锌还原柱：4.6mm×50mm（填料：锌粉，锌粉平均粒径70μm。锌粉还原柱可直接购买商品柱，此锌粉还原柱连接于色谱柱后）。5.3.3荧光检测器：激发波长为326nm，发射波长为410nm。5.3.4流动相：等度洗脱（按3.2.3配制）。5.3.5流速：0.8mL/min
5.3.6进样量：20μL。bzxz.net
5.3.7标准溶液的色谱图见附录A中图A.1。5.4标准曲线的制作
分别将MK-4、MK-7、MK-9标准系列溶液按照浓度由低到高的顺序注入液相色谱仪中，以测得的峰面积为纵坐标，以MK-4、MK-7、MK-9各组分含量（μg/mL）为横坐标，制作标准曲线。5.5试样溶液的测定
将制备的试样溶液注入液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到制备的试样溶液中MK-4、4
MK-7、MK-9各组分的含量（ug/mL)。分析结果的表述
固体、半固体试样的质量(ms）按公式（1)计算。mm
式中：
试样的质量，单位为克(g);
均质样品的质量，单位为克（g）：称取的匀浆混合样品的质量，单位为克（g）：均质加水后的溶液的质量，单位为克(g)。试样中维生素K2各组分的含量X(MK-4、MK-7、MK-9)按公式(2)计算。,=XVXI
式中：
(μg/kg):
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试样中维生素K2各组分的含量（分别是XMK4、XMK，、XMk-9),单位为微克每千克试样溶液中维生素K2各组分的浓度，单位为微克每毫升（uμg/mL）：试样溶液的体积，单位为毫升(mL);一试样的稀释倍数：
试样的质量，单位为克（g）：
1000—
换算系数。
计算结果以重复性条件下获得的2次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。7精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。8其他
当试样的质量（ms）为2g时，四烯甲萘醒（MK-4）方法检出限为70.0μg/kg，定量限为200μg/kg;七烯甲萘醒（MK-7）方法检出限为70.0μg/kg，定量限为200μg/kg；九烯甲萘醒(MK-9）方法检出限为160μg/kg，定量限为510ug/kg。5
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附录A
四烯甲萘醒（MK-4)、七烯甲萘醒（MK-7)、九烯甲萘醒（MK-9）标准溶液色谱图LU
μg/mL)、七烯甲萘醒(MK-7)（1.0μg/mL)、四烯甲萘醒(MK-4)(1.0
pg/mL)标准溶液色谱图
九烯甲萘醒(MK-9)(1.0
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