【SN商检标准】 国境口岸蜱类携带新布尼亚病毒 SYBR Green荧光PCR检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3884—2014
国境口岸蜱类携带新布尼亚病毒SYBR Green荧光 PCR检测方法　Detection of tick-borne novel Bunyavirus by SYBR Grcen PCRmethod at frontier port
2014-01-13发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-08-01 实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起节。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归「。SN/T3884—2014
本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检校局，军事医学科学院、中华人民具和国农业部规划设计研究院
本标准起草人：用洁、刘艳华、王艺凯、郭慧琳、江住富、贾娜、叶锋、孔等锌、蒋宝贵、张丽杰、任T
1范围
国境口岸蜱类携带新布尼亚病毒SYBRGreen荧光PCR检测方法
SN/T3884—2014
本标准规定了国境口岸蜱新布尼亚病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法，包括标本采集，处理、检测程序、结果判定及报告。
本标准适用于国境口岸蜱携带发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒的实验室检验，2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1293国境口岸蜱类监测规程WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则人间传染的病原微生物名录
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
中华人
新布尼亚病毒newbunyavirus
发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Severe fever
with thrombocytopenia syndrome bunyavirus.SFTSV），简称新布尼亚病毒，是我国新发现的一种布尼亚病毒，属于布龙亚病毒科白病毒属，为分节
段的负链RNA病毒。病毒颗粒呈球形，直径80nm100nm.外有脂
质包膜，表面有棘突，该病毒引起新发传染病发热伴血小板减少综合征，临床上主要表现为发热多脏器功能损伤。
SYBRGreen荧光定量PCR法
小板和白细胞减少、消化道症状及在PCR反应体系中，加人过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性的掺人DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
4.1RT-PCR逆转录聚合酶链式反应。（reversetranscriptionpolymerasechainreaction）4.2Ct值
循环阈值，每个反应管的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。（cyclethreshold）4.3RNA
核糖核酸。（ribonucleicacid)1
SN/T 3884--2014
4.4PBS缓冲液含0.5%叶激20的pH7.4的磷酸盐缓冲液。5实验室生物安全要求
中华人民共和国卫生部发布的人创传染的病原微牛物名录》规定，布尼死病毒危害程度分类为第类，所有有关布尼亚病毒的实验室操作应按照以下规定执行：一布尼亚病毒培养和动物感染实验应在尘物安全二级（HSL2或ABS1.2)实验室内逃行；-末经培养的布尼亚病毒感染性材料的操作应在生物安全二级(BSL2)实验室内进行；一：布尼亚病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安会…-级(BSL1)实验空内进行： 布尼业病毒燃染性材料运输包装分类为B类(仪培养物为B类),UN编号为 N3373;H他要求按GI319489和WS233进行。6检测对象
6.1出人镜交通1.兵、集装箱、货物等场所采集的游离蝉或从上述场所宿土体表采集的奇生蝉。6.2口黑地区采集的游离蜱或从上述地区宿体表来集的奇生蜱。7试剂
7.1标本处理液:在新鲜配制的 95 mL MEM 中川人 56 ℃ 热灭活 30 min 的胎牛而清 2 mil、1 mL庆人霉素（5000μg/ml.）,lml.两性得素B(250μg/mL)和1tnL青链霉索（青霉素G10000U/ml.,链霉素10 090 μg/m1.),用7.5%碳酸氢钠溶液调至pH7.2.7.2Hank液;磷酸-氧钾n,06g,氯化钠8,0g，碳酸氢钠0,35 g，氯化钾0.4g，葡萄糖1.0 g，磷酸氢一钠(NHP0H,)0.C6 ,加水至1000 mL。Hank’s液可以高压灭菌,分装于4 ℃下保存。7.3裂解液：Trizol-rcagentl或其他等效产品。7.4三氯巾烷，
7.5 异丙醇。
7.675%乙醇。
7.7病母RNA提最试剂盒
7.8(One Stcp SYHR@ PrimeSeript? PlUS RT-PCR Kit，宝生物工程（大连)有限公司产品。7.9无RNase水
7.10引物。
7.11
7.12
阳性刘照布尼亚病毒cI)NA或含布尼亚病毒月的基因的质粒。阴性对照：不含布尼亚病的螺cDVA8
主要仪器设备
8.1 实时荧光 PCR仪。
8.2一级生物安全相。
8.3高压灭菌器，
1）它）给出这一信息是为了方便本标游的使川者,并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品尽有相同的效果，则可使用这些等效产品。
TTKAONKAca
8.4一70℃超低温冰箱（或液氮罐）。8.5普通冰箱。
8.6高速台式冷冻离心机（最高转速2000以上）。SV/T 3884—2014
8.7微量可调移液器（10ul.2001000L)及配套的无RVa5e一次性带滤芯吸头。8.8旋涡混合器。
8.9无RNase的研磨器，
9样品采集与处理
9.1样品采集
绅类采集参照S.V/T1293的规定执行。在采集过程中做好个人防护，防止被蟀类叮咬。9.2样品运输和保存
将采集的活体蜱虫运输回实验室，保持蜱虫存活，在实验室中效人人工气候箱中保存待检。将采集的死亡蜱虫放人液氮中运输回实验室，在液氮或一70℃冰箱中保存待检。9.3样品的制备
在冰上操作。从一70℃以下超低温冰箱或液氮中取出蜱标本，用无菌剪剪碎后;倒入研磨器巾，加入H2nk's液1inI.吹洗，弃去液体后加人1tmil.标本处埋液，反复研磨至纠织碎片基本消失，随后将研磨物吸人 1,5 nL eppendarf 离心管，乎衡后箐预 4 C的离心机l:12 000 r/min.l0 min。取 上清薇提取核酸逊行SYBRGIeen荧光定量PCR检测。剩余的蜱样品研磨液需保存准7O℃以下超低温冰箱以备复查，
10样品检测
10.1核酸提取
10.1.1商品化RNA提取试剂盒提取核酸用商品化的RNA提取试剂盒（已取得医疗器械许可证)处理标本，具体操作参见该试剂盒说明书，10.1.2Trizol法提取核酸
取蜱标木研磨液置丁 1.5 ml.离心管中,加人1 mL Trizol,再加人 200 μL二氯中烷，混勾器上振荡混句5 s或颠倒混匀15次;13001t/min离心15tsin，吸取上层液体，删人等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min,13000r/inin离心10 inin.轻轻倒去L清：加人700μl.75%乙醇，颠倒洗涤，13000 r/mir离心5 min,轻轻倒去上清,倒置于吸水纸.l:,充尽液体或1 000 r/tuin离心 5 s,将管髋上的残余液体甩到管底部,用徽量加样器尽量吸十液体,加人20 μL无RNase水溶解 RNA。10.2荧光定量 PCK
10.2.1引物和目的基因
上游引物:BNY55105'ATCCTCAACCTCTCTGTCACCATAC 3下游引物:BNY56545＇ACGGCTCCTTCTTCCCAAA 3’自的基因为新布尼亚病毒基因组M节段，长145bp，序列为：atectciacc tetcigtcaccatacaagaa-TTKAONIKAca
SN/T3884-2014
ggaagggtca tgaacatcct aagctacagg ccgagagaca ctgatatatc agagtcagcc gcagcatacc tctggagcaa tcgagacctcttcteetttg ggaagaagga gccgl
10.2.2
反应体系
反应体系见表1。
实时荧光RT-PCR反应体系
RT-PCT反应液
2×缓冲液
Takara ExTag HS Mix
FrmerSeripuPLUS RTase此内容来自标准下载网
10~M下游引物
50x
RNA模板
反应体系为20μL或50uL，不足的用无RNase水补10.2.3扩增程序
42℃x5min95℃x10s；95℃x5s-60℃x2065℃X15s.95℃X1s(0.1℃/s)由
10.2.4
基线和对照
使用终浓度
0.06μM
0.02μM
0.4μM
0.4mM
34$循环40次：溶解曲线分析95℃×1s，的荧光完量PCR仪性能有差异，可适当调整扩增反应程序。司
基线调整取6个～15个循环
的蒙光
号，阅值设定
曲线的最好点，也可根据仪器噪音整。
情况调
阳性对照为布尼亚病毒cDNA或合DNA。
10.3
结果判定
10.3.1
质量控制
则以國值线刚好超过阴性对照品的检测荧光尼亚病毒目的基因的质粒，阴性对照为不含布尼亚病毒的蜱反应结果应同时符合表2的两个条件，否则实验结果无效实时荧光RT-PCR质量控制指标
对照品
阴性对照品
阳性对照品
10.3.2
结果报告
10.3.2.1
阴性结果
FAM通道Ct值
UNDET或40
≤35，并有明显扩增曲线
Ct值UNDET或>38，且无明显扩增曲线，报告为新布尼亚病毒SYBRGrccn荧光RT-PCR检测4
-TTKAONi KAca
阴性。
10.3.2.2
阳性结果
SN/T 3884—2014
C1值35，并有明显扩增曲线，报告为新布尼亚病每SYBKGreen荧光RT-PCR检测阳性10.3.2.3可疑结果
C1值36～38，需要重做，若C1值仍在36～38之间，Il.曲线有明显的指数增长特性，可报件为新布尼业病毒SYBRCreen荧光RTPCR检测阳性·否则报告为新布尼亚病毒SYBRGreen荧光RT-PCR检测阴性：
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