【SN商检标准】 进出境猴麻疹病毒病检疫技术规范

SN/T 4067—2014 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 进出境猴麻疹病毒病检疫技术规范 Quarantine protocol for measles to entry-exit 发布日期：2014-11-19 实施日期：2015-05-01 国家质量监督检验检疫总局 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国海南出入境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫局、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：李丹丹、徐义刚、艾军、季新成、徐维加、林志雄、吴山楠、黄纪徽。 1 范围 本标准规定了猴麻疹病毒的病原分离、病毒中和试验、实时荧光定量PCR试验、阻断ELISA抗体试验的技术要求。 本标准适用于进出境猴麻疹病毒的检疫。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 SN/T 2025 动物检疫实验室生物安全操作规范 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 B95a细胞：绒猴淋巴母细胞 CPE：致细胞病变作用（cytopathic effect） Ct值：荧光信号到达设定的阈值所经历的循环数（cycle threshold） ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay） MV：麻疹病毒（measles virus） TCID50：半数组织培养感染量（tissue culture infectious dose 50） 4 初步诊断 该病的介绍参见A.1，可根据临床诊断和病理变化进行初步诊断，参见A.2、A.3，确诊还需实验室诊断。 5 病毒分离 5.1 设备和器材 倒置光学显微镜、二氧化碳培养箱、冰箱（-20℃~-70℃）、50μL、100μL微量可调移液器、无菌96孔细胞培养板、无菌塑料滴头、无菌塑料离心管（1.5mL）或5mL~10mL无菌玻璃试管、无菌棉拭子。 5.2 试剂和材料 5.2.1 病毒：MV病毒标准毒株。实验环境和防护要求见GB 19489。 5.2.2 血清：MV标准阳性血清、阴性血清。 5.2.3 被检样品：病猴呼吸道或血液采集标本。若需要长途运输，应将病料置于含有高浓度抗生素运输液中（每毫升5000IU青霉素，5000μg链霉素和10μg两性霉素B）。 5.2.4 细胞：原代人胚肾细胞或其他原代细胞如人羊膜、人胚肺、猴肾等或人二倍体细胞或传代细胞如B95a细胞，一般不超过四代，按常规胰酶消化方法制备。 5.2.5 培养液：199培养液、生长液中加10%胎牛血清，维持液中加3%（或无）胎牛血清，含青霉素200IU/mL、链霉素200μg/mL。 5.2.6 细胞分散液：0.25%胰蛋白酶。 5.3 样品采集 宜在皮疹出现前，柯氏斑出现时采集样品。将灭菌棉棒稍蘸液体（2%牛血清Eagle液），反复涂抹病猴咽部数次，然后将棉棒浸入含有高浓度青霉素和链霉素的无钙镁PBS液中（1mL~1.5mL）反复挤压。加肝素抗凝的血液白细胞中也可分离病毒。 5.4 病毒培养 取0.1mL~0.2mL样品液接种于生长在试管中的单层原代人胚肾细胞（或其他原代细胞如人羊膜、人胚肺、猴肾等或人二倍体细胞或传代细胞如B95a细胞）上，37℃培养1h后弃液，再加入含双倍常规抗生素量的细胞维持液1mL，37℃培养。开设未接种样品的空白对照培养。逐日观察，待80%~90%细胞出现病变时收获病毒悬液，经冻融或超声波处理后，以3000r/min离心10min，取上清液，分装小瓶，置-70℃保存备用。若未见病变需连续盲传三代，每次培养观察2周，如仍不出现病变则为阴性。 6 病毒中和试验 6.1 病毒繁殖 收获B95a细胞上出现CPE的病毒悬液，复传一代，待CPE达85%以上，收获病毒培养物冻融1次，3000r/min离心10min，取上清，分装置-70℃保存备用。 6.2 病毒毒力测定 制备的病毒抗原或购进的标准病毒抗原，用维持液将其作10倍递增稀释至10^-1，每一梯度病毒稀释液接种细胞培养板八孔，每孔50μL。随后每孔加人细胞悬液（3×10^5个细胞/mL）100μL和细胞培养液50μL。同时，每板设8孔细胞对照。置37℃二氧化碳培养箱培养，从24h~168h逐日观察细胞病变，按Karber方法计算培