【SN商检标准】 葡萄角斑叶焦病菌检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3753—2013
葡萄角斑叶焦病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Pseudopezicula tracheiphila(Miller-Thurgau)Korf etZhuang
2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3753—2013
本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：段维军、郭立新、陈先锋、杜洪忠、张慧丽、顾建锋。1
1范围
葡萄角斑叶焦病菌检疫鉴定方法本标准规定了葡萄等寄主植物上的葡萄角斑叶焦病菌的形态学检疫鉴定方法。本标准适用于葡萄角斑叶焦病菌的检疫鉴定。2葡萄角斑叶焦病菌基本信息
学名：Pseudopeziculatracheiphila（Muller-Thurgau)KorfetZhuang(1986）曾用名：PseudopezizatracheiphilaMull.-Thurg（1903）无性型：Phialophoratracheiphila（Sacc.&.D.Sacc.)Korf1986SN/T3753—2013
分类地位：真菌界（Fungi）、子囊菌门（Ascomycota）、锤舌菌纲（Leotiomycetes）、柔膜菌目（Helotia-les）、柔膜菌科（Helotiaceae）、无柄盘菌属（Pseudopezicula）。传播途径：病菌可随风、雨、昆虫和田间操作传播，随感病叶片和果穗远距离传播。该病菌的其他相关资料参见附录A。方法原理
以葡萄角斑叶焦病菌的培养性状和病原菌形态特征作为鉴定依据。仪器设备和主要试剂
仪器设备
生物显微镜、超净工作台、高压灭菌器、生物培养箱、滤纸、手持放大镜、培养皿、烧杯、镊子、剪刀、载玻片、盖玻片、量筒、吸管、滤纸、酒精灯。2试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯。麦芽汁、琼脂、次氯酸钠、无菌水、氢氧化钾、三氯乙酸、碘化钾、碘、蒸馏水。
5病菌的鉴定
症状检查
挑取病株，进行观察。病害症状描述参见附录A。5.2染色观察
5.2.1染剂
梅瑞氏染剂（Melzersreagent）：称取三氯乙酸100g、碘化钾5g、碘5g，加蒸馏水定容至100mLSN/T3753—2013
后使用。
梅瑞氏染剂可直接滴加于玻片作为负载剂使用。5.2.2染色方法
挑取病叶，将坏死和健康交界处表现红色或黄色叶片用2%氢氧化钾液体煮沸2min～3min，将剪碎叶片放置在玻片上，盖上盖玻片，滴加梅瑞氏染剂后，在显微镜下镜检观察子囊和子囊孢子的有无。5.3病菌的分离培养
5.3.1培养基
麦芽汁培养基（MEA）：称取麦芽汁25g、琼脂20g，加热煮至琼脂完全溶化后，加蒸馏水补足1000mL，121℃高压灭菌20min。
或选用市售麦芽汁培养基，高压灭菌后使用5.3.2分离培养
将病健交界处剪成1mm22mm2的小块，将这些小块用0.5%次氯酸钠溶液消毒30s后，吸于水分，放置在2.5%麦芽汁培养基平皿上，将平血放置在20℃培养箱中，每天16h荧光照射，以诱发子囊孢子的产生。培养10d～15d后，观察并记录菌落特征囊、子囊孢子等形态特征。
6鉴定特征
6.1培养性状
在显微镜下观察有性繁殖器官，如子囊盘、子葡萄角斑叶焦病菌的菌落正面白褐色，气生菌丝少，背面浅褐色，参见附录B。6.2病原菌形态特征
子囊盘垫状，无柄，新鲜时直径可达0.6mm，裂出于叶部组织，大多生长在叶背面；子实层新鲜时白色，干燥时浅褐色。子实层平均厚度为10m130pm。
子囊无囊盖，内有8个子囊孢子，子囊一端膨大成棍棒状，另一端渐细，用氢氧化钾进行前处理后再用梅瑞氏染剂对子囊顶端进行染色实验，可在顶端产生蓝色有顶环（十），如果不用氢氧化钾进行前处理则无法看到蓝色有顶环，子囊大小为（115μm~145μm）×（18mm~28μm）。子囊孢子椭圆形或一端扁平形，单核，透明无色，有油滴，（19.8μm～25.7μm）×（9.3μm～14.0μm）。侧丝丝状，有隔膜，透明，分枝且弯曲，或者在尖端略微变形，宽2.2μm～2.7μm。无性型Phialophoratracheiphila分生孢子椭圆形，透明，单细胞，其上有油滴，平均直径为（2.0uμm~3.7μm）×（1.4μm~1.9μm）。分生孢子梗在形态上与营养菌丝有所不同，为烧瓶状单瓶梗，有时轻微弯曲。
葡萄角斑叶焦病菌与近似种病原形态图及其区别，参见附录C和附录D。7结果判定
以分离物的培养特征和培养性状作为鉴定依据，进行综合判定。若以上特征与6.1、6.2鉴定特征符合，判定为葡萄角斑叶焦病菌。2
样品保存与处理
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样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出葡萄角斑叶焦病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。9菌株保存与处理
将菌株转接在麦芽汁斜面上培养，待菌丝体长满斜面后，置于4℃下保存，并定期（180d)转管，标注分离物来源、寄主、分离时间和鉴定人10
结果记录与资料保存
及时高压灭菌处理。
妥善保存检验报告，包括症状、病菌、形态特征宏观以及微观图像等图文资料，以备复验、谈判和仲裁。检验报告应注明检验日期、方法、结果等，并有检验人签名。S
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A.1地理分布
附录A
（资料性附录）
葡萄角斑叶焦病菌的相关资料
欧洲：俄罗斯、比利时、瑞士、德国、奥地利、法国、南斯拉夫（前）、罗马尼亚、乌克兰。亚洲：土耳其、约旦。
北美洲：美国。
非洲：阿尔及利亚、突尼斯。
寄主范围
葡萄属（Vitisspp.）植物，包括甜冬葡萄（Vitiscinerea）、美洲葡萄（Vitislabrusca）、欧洲葡萄（Vitisvinifera）等。
病害症状
植株叶片受侵染后，初期受叶脉限制表现局部角斑状变色褪绿，形成红色或黄色斑块，随后受侵染部位开始坏死，晚秋季节受侵染叶片似雀斑状，可导致未成熟叶片落叶。病菌也可侵染花穗，造成干枯。果实不会直接受侵染。但是花梗和穗轴部分可能会被侵染，造成受侵染果实末梢干枯。注：引自W.Siegfried undO.Viret，1996图A.1
葡萄角斑叶焦病菌侵染初期葡萄叶片表现症状注：引自W.Siegfried und O.Viret，1996。图A.2
葡萄角斑叶焦病菌侵染葡萄后期植株表现症状注：引自W.Siegfried undO.Viret，1996。图A.3
葡萄角斑叶焦病菌侵染葡萄果穗表现症状SN/T3753—2013
SN/T3753—2013
附录B免费标准bzxz.net
（资料性附录）
葡萄角斑叶焦病菌的菌落形态特征a）麦芽汁培养基正面
注：Pseudopeziculatracheiphila菌株来自CBS308.86，段维军摄。图B.1
b）麦芽汁培养基反面
葡萄角斑叶焦病菌在麦芽汁培养基平板上的菌落形态特征项
有性型
无性型
无性型形态
有性型形态
附录C
（资料性附录）
葡萄角斑叶焦病菌与近似种的比较葡萄角斑叶焦病菌与近似种的比较表C.1
葡萄角斑叶焦病菌（八孢假无柄盘菌）Pseudopeziza tracheiphila
Phialophora tracheiphile
分生孢子梗为烧瓶状单瓶梗，透明，有隔膜较营养菌丝粗糙和短小。分生孢子椭圆形，透明，单细胞，内有油滴状物，平均直径为
(2.0μm~3.7μm)×(1.4μm~
子囊盘垫状，无柄，新鲜时直径可达子囊无囊盖，具有
个子囊孢子，子囊
一端膨
一端逐新尖细，子囊大小为
大成棍棒状，另
（115μm~145μm）×（18μm~28μm）：子囊端扁平形，单核，透明无色，有孢子椭圆形或一
油滴，（19.8μm~25.7μm）×（9.3μm~14.0μm)
分生孢
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四孢假无柄盘菌
Pseudopeziza tetraspora
Phialophorasp.（未定名）
子梗与分生孢子形态与葡萄角斑叶焦病菌相似，分生孢子平均直径为μm~5.5μm）×（2.0μm~2.3μm）子囊盘垫状，无柄，新鲜时直径可达mr
囊袍子
（20μm
0.3mm；子囊无囊盖，具有4个子囊大小为（80μm~100μm）×
22μm)；子囊孢子椭圆形或一端扁双核，（24.2μm~32.5μm）×
11.0μm~14.7μm)
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