【SN商检标准】 螯虾瘟检疫技术规范

SN/T 4348—2015 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 螯虾瘟检疫技术规范 Quarantine protocol for crayfish plague 2015-12-04 发布 2016-07-01 实施 国家质量监督检验检疫总局 前言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。 本标准修改采用世界动物卫生组织（OIE）《水生动物疾病诊断手册》（2014年版）的 2.2.1，主要修改如下： - 原文格式及内容顺序排版上作了调整，按照 GB/T 1.1—2009 进行编写； - 原文中“Disease information”内容经修改简缩后作为本标准附录 A； - 删除了原文“4.2 Clinical methods”内容； - 原文 4.3.1.2.3.1 普通 PCR 上游引物（B042）序列为 5'-GCT-TGT-GCT-GAG-GAT-GTTCF-3'。该引物序列 3' 末端有误。经与 OIE 参考实验室专家确认，正确的引物序列为 5'-GCT-TGT-GCT-GAG-GAT-GTT-CT-3'； - 增加了实时荧光 PCR 方法 Ct 值的描述； - 对原文“7. Corroborative diagnostic criteria”的表述形式进行了调整。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：贾鹏、史秀杰、王津津、于力、郑晓聪、何俊强、兰文升、刘、陈兵、王红英、叶奕优。 1 范围 本标准规定了螯虾瘟的临床症状、病原分离、普通 PCR 和实时荧光 PCR 检测方法。本标准适用于螯虾瘟的诊断、流行病学调查和监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 概述 螯虾瘟（crayfish plague）是由 Aphanomyces astaci 感染士足目螯虾科和刺科螯虾的一种水生动物传染性疾病。A. astaci 属于藻界、卵菌门（Oomycota）、卵菌纲（Oomycetes），包括硅藻和褐藻。根据宿主对 A. astaci 的易感程度，检疫对象分为北美螯虾和高度易感螯虾两大类。北美螯虾是指野生或养殖于北美地区的所有种类螯虾，是 A. astaci 的自然携带者，被感染后通常无临床症状或死亡。高度易感螯虾是指除北美螯虾外，对 A. astaci 易感且易出现临床症状或死亡的螯虾（参见附录 A）。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ITS：核糖体 DNA 内转录间隔区（internal transcribed spacer） ITS1：核糖体 DNA 内转录间隔区 1（internal transcribed spacer 1） PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide） UNG：尿嘧啶-N-糖基化酶（uracil-N-glycosylase） Ct：循环阈值（cycle threshold） 5 仪器和设备 5.1 倒置显微镜 5.2 冷冻离心机 5.3 微量移液器 5.4 PCR 扩增仪 5.5 实时荧光 PCR 仪 5.6 水平电泳仪 5.7 凝胶成像仪 5.8 超净工作台 5.9 恒温培养箱 5.10 二级生物安全柜 6 试剂和材料 6.1 水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 6.2 螯虾瘟菌株：由指定单位提供。 6.3 无水乙醇，分析纯，使用前预冷至 -20℃。 6.4 70% 乙醇。 6.5 DNA 聚合酶：-20℃ 保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 6.6 dNTPs：含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP。 6.7 螯虾瘟普通 PCR 检测引物 B042/B0640：上游引物 B042：5'-GCT-TGT-GCT-GAG-GAT-GTT-CT-3'；下游引物 B0640：5'-CTATCC-GAC-TCC-GCA-TTC-TG-3'；扩增 A. astaci ITS 基因中大小为 569bp 片段。 6.8 螯虾瘟普通 PCR 复核引物 TS1/TS4：上游引物 TS1：5'-TCC-GTA-GGT-GAA-CCT-GCG-G-3'；下游引物 TS4：5'-TCC-TCC-GCT-TAT-TGA-TAT-GC-3'；扩增 A.