【SN商检标准】 多子小瓜虫检疫技术规范

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4290—2015 多子小瓜虫检疫技术规范 Quarantine protocol for Ichthyophthirius multifilis 2015-09-02 发布 2016-04-01 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 前言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国海南出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：郭书林、陈信忠、吴山楠、龚艳清、杨俊萍、黄纪徽、孔凡德。 1 范围 本标准规定了多子小瓜虫的临床诊断、形态学诊断和 PCR 检测方法。本标准适用于多子小瓜虫病的病原鉴定及其流行病学调查和监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 滋养体 (trophont)：多子小瓜虫的寄生阶段，指感染期幼虫从进入鱼的皮肤或鳃，至发育成熟并离开鱼体的阶段。 3.2 包囊 (tomont)：寄生于宿主的滋养体脱离宿主在水中自由活动形成包囊。 3.3 幼虫 (theront)：包囊连续分裂形成大量幼虫，幼虫破囊而出，长大形成感染期幼虫。 4 疾病概述 由多子小瓜虫 (Ichthyophthirius multifiliis) 寄生鱼体引起的传染病称为多子小瓜虫病 (ichthyophthiriasis)，又称白点病。该虫对大多数淡水和半咸水鱼类都易感。鱼类因该虫的感染，以及因该虫造成的损伤继发其他病原的感染，可造成大批死亡。多子小瓜虫病详细内容参见附录 A。 5 试剂和材料 5.1 所有化学试剂均为分析纯。实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。用于 DNA 提取及 PCR 实验的水需用灭菌双蒸水。 5.2 绍丁氏固定液 (Schaudinn's solution) (配制见附录 B 中 B.1)。 5.3 波恩氏固定液 (Bouin's solution) (配制见 B.2)。 5.4 海登汉铁苏木精染色液 (Heidenhain's iron haematoxylin) (配制见 B.3)。 5.5 10% 的甘油乙醇 (配制见 B.4)。Taq 酶、dNTPs (含 dATP、dUTP、dCTP、dGTP) 等 PCR 所需试剂可选用商品化试剂和试剂盒。 5.6 阳性对照为多子小瓜虫滋养体。 5.8 PCR 引物：XGCF: 5'-GTACTTTATTTAGGAGGAGGACT-3', XGCR: 5'-TGTTTAACGAGAGAAAATCATAAAT-3' 5.9 CTAB 溶液 (配制见 B.5)。 5.10 抽提液 1 (配制见 B.6)。 5.11 抽提液 2 (配制见 B.7)。 5.12 TBE 电泳缓冲液 (配制见 B.8)。 5.13 核酸染色剂 (EB) (配制见 B.9)。 5.14 上样缓冲液 (配制见 B.10)。 6 器材和设备 6.1 普通 PCR 仪。 6.2 显微镜。 6.3 立体显微镜。 6.4 高速冷冻离心机。 6.5 解剖器具。 6.6 微量移液器。 6.7 电泳仪。 6.8 凝胶成像分析系统或紫外检测仪。 6.9 载玻片和盖玻片。 7 临床诊断 多子小瓜虫对大多数淡水和半咸水的不同年龄段鱼类都易感，其中，对鱼苗、鱼种、观赏鱼类及越冬后期的鱼种等影响严重。主要寄生于鱼的皮肤、鳍、鳃和口腔等部位。鱼体感染多子小瓜虫病时，其皮肤、鳍条和鳃瓣上形成许多直径 1mm 左右的小白点，严重时，躯干、头、鳍、鳃和口腔等处都布满小白点，体表似覆盖一层白色薄膜，有时眼角膜上也有小白点，并伴有大量黏液覆盖于体表和鳃丝 (参见附录 A)。因黏孢子虫病、打粉病等多种病，其体表症状与多子小瓜虫病相似，所以临床诊断法仅可作为初步诊断。 8 实验室诊断 8.1 虫体的收集 收集从鱼体脱落沉集于容器底部的多子小瓜虫，或从活鱼皮肤、鳍、鳃、头、鳞片、角膜、口腔、眼、鼻等部位刮取组织样本。显微镜观察用虫体可用 5% 福尔马林固定保存；PCR 检测用虫体和鱼体组织可保存于 70% 的乙醇中，或于 -20℃ 以下冻存备用。 8.2 形态学诊断 8.2.1 皮肤组织涂片法 8.2.1.1 涂片采集和检查 取洁净载玻片，按压或刮取鱼体受感染部位的上皮细胞。