【SN商检标准】 杨树炭团溃疡病菌检疫鉴定方法

SN/T3434—2012 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 杨树炭团溃疡病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Hypoxylon mammatum (Wahlenberg) J. Miller 2012-12-12发布 2013-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：吴兴海、陈鹏、白桦、王英超、厉艳。 1 范围 本标准规定了进出境种苗、原木及木质包装检疫中杨树炭团溃疡病菌的检疫和鉴定方法。 本标准适用于进出境植物及其产品中杨树炭团溃疡病菌的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 SN/T 1157 进出境植物苗木检疫规程 3 杨树炭团溃疡病菌基本信息 学名：Hypoxylon mammatum（Wahlenberg）J. Miller 异名： Hypoxylon pruinatum（Klotzsch）Cooke； Entoleuca mammata； Sphaeria mammata； Nemania mammata； Sphaeria pruinata； Rosellinia pruinata； Hypoxylon pauperatum； Anthostoma morsei； Hypoxylon morsei； Hypoxylon blakei； Anthostoma blakei； Hypoxylon holwayi； Fuckelia morsei。 俗名：Black stem canker。 分类地位： 子囊菌门（Ascomycota），子囊菌纲（Ascomycetes），炭角菌目（Xylariales），炭角菌科（Xylariaceae），炭团菌属（Hypoxylon）。 传播途径： 杨树炭团溃疡病菌主要是一种气传病害，可通过风、雨、昆虫、修剪工具等进行传播。 杨树炭团溃疡病菌的其他信息参见附录A。 4 方法原理 根据杨树炭团溃疡病菌的形态特征及致病性测定的症状特征，对该病菌进行检疫鉴定及结果判定。 5 仪器和用具 超净台、生物培养箱、荧光显微镜、离心机、涡旋器、生物显微镜、体视显微镜、光照培养箱、高压灭菌器及其他常规实验室设备器具。 6 药品试剂与培养基 NA培养基、2%次氯酸钠或75%乙醇、甘露醇、6-苄氨基嘌呤（6-BA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、3-吲哚丁酸（IBA）、改良B5培养基、WPM培养基等。 7 现场检疫 7.1 抽样方法 对来自杨树炭团溃疡病菌发生国家和地区（参见附录A）的寄主植物及其产品，按SN/T 1157进行抽样。 7.2 症状检查 在寄主植物上，初期症状表现为植株外表皮出现橙黄色、水渍状凹陷，并逐渐形成绿色块状开裂，周缘呈黄色。后期在水泡状外皮下出现灰色或橄榄绿色团块状组织及特征性的钉状精配子柱。 由凹陷处或块状外表皮边缘向内切开皮层及维管束，可见皮层呈层状或斑驳状，颜色为淡黄色或黑色，形成层出现白色扇状菌丝体。 在组织培养再生苗上，症状表现为叶片萎缩、茎部表皮变黑。 应收集可疑植物材料并带回实验室检验。具体症状参见附录A。 8 实验室检测 8.1 病原菌分离与培养 对于具有7.2中初期症状的样品材料，用解剖刀切取植物茎段，装入铺有潮湿纸巾的广口瓶中，加盖后置于培养箱内，在24℃～28℃、湿度95%～100%的条件下保湿培养。 从第4天开始观察外皮症状，包括表皮由绿色块状变为水泡状，局部表皮向上翘起并进一步裂开，最终露出精配子柱。 对于具有典型症状的样品材料，检查子实体结构，切取白色或黑色子座，在解剖镜或100×～200×显微镜下，通过徒手切片或石蜡切片制成玻片，观察子囊壳和子囊孢子。 若发现子囊孢子，可挑取单个孢子进行单孢分离，形成菌落后移至NA培养基纯化。若发现菌丝，则用灭菌针挑取菌丝进行分离培养和纯化。 对于无明显症状的样品，取伤口或开裂处组织切成细条，在75%乙醇溶液中浸泡1 min，再用2%次氯酸钠溶液进行表面消毒5 min，无菌水冲洗3次后接种于NA培养基，在24℃～28℃条件下培养2 d～4 d。 随后用灭菌挑针挑取组织块边缘菌丝，转移至新的NA培养基进行纯化。 应注意观察菌落特征，记录菌落和菌丝体特征，并测定精配子柱、子囊和子囊孢子的大小。 8.2 致病性测定 8.2.1 致病性接种应在无菌条件下完成，接种寄主可选用易感品种美洲山杨（Populus）。