【SN商检标准】 马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法

SN/T3437—2012 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of potato spindle tuber viroid 2012-12-12发布 2013-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局、黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所。 本标准主要起草人：刘洪义、刘忠梅、陈红运、吕典秋、邱彩玲、张洪祥、王振华、杨立群、刘尚武。 1 范围 本标准规定了马铃薯纺锤块茎类病毒（Potato spindle tuber viroid，PSTVd）的检疫鉴定方法。 本标准适用于检测可能带有马铃薯纺锤块茎类病毒的马铃薯脱毒苗、试管苗、种薯、商品薯、大田中生长的马铃薯及收获后的块茎，以及番茄、鳄梨、人参果等其他寄主植物。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡注日期的引用文件，仅注日期版本适用于本文件；凡不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 原理 3.1 马铃薯纺锤块茎类病毒基本信息 种名：Potato spindle tuber viroid 缩写：PSTVd 异名： potato spindle tuber virus； potato gothic virus； tomato bunchy top virus。 分类： 马铃薯纺锤块茎类病毒科（Pospiviroidae），马铃薯纺锤块茎类病毒属（Pospiviroid）。 马铃薯纺锤块茎类病毒的其他信息参见附录A。 3.2 检疫鉴定依据 PSTVd的基因组特征和在寄主植物上的症状特征是检疫鉴定的依据。 PSTVd是一种具有侵染性、无外壳蛋白、高度碱基配对的棒状共价闭合环状单链RNA分子。PSTVd的RNA变性后转变为开环状分子，这种环状RNA分子在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率比相同相对分子质量的线状分子慢得多。 依据基因组特征建立了往返聚丙烯酰胺凝胶电泳（Return-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，R-PAGE）、RT-PCR和实时荧光RT-PCR（Real-time PCR）检测方法。这些方法结合寄主植物症状的有无及症状特征（参见附录A），判断样品是否带有PSTVd。 4 仪器设备、用具及试剂 4.1 仪器设备 PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、垂直电泳槽、小型离心机、台式冷冻离心机、水浴锅、凝胶成像系统、制冰机、冷藏冷冻冰箱、电子天平、涡旋振荡器、烘箱等。 4.2 用具 可调移液器（0.1 μL～2.5 μL、2 μL～20 μL、10 μL～100 μL、20 μL～200 μL、100 μL～1000 μL）及配套吸头、离心管、研钵、微型磨杆等。 4.3 试剂 主要试剂见附录B、附录C、附录D。 5 检疫鉴定 5.1 检测方法的选择及检测鉴定流程 本标准采用RT-PCR、实时荧光RT-PCR（Real-time PCR）及往返聚丙烯酰胺凝胶电泳（R-PAGE）检测方法。 进口脱毒苗、试管苗检测流程： 首先进行隔离种植和症状检查，然后采用R-PAGE、RT-PCR或实时荧光RT-PCR进行初级检测。 若检测结果为阴性且无症状，则判定PSTVd阴性。 若检测结果为阳性或出现症状，则进行二级检测试验。二级检测仍采用R-PAGE、RT-PCR或实时荧光RT-PCR方法。 若二级检测结果为阳性且伴有症状，则判定样品带有PSTVd；若检测阴性且无症状，则判定PSTVd阴性。 进口种薯、商品薯检测流程： 采用R-PAGE、RT-PCR或实时荧光RT-PCR进行初级检测。 若检测结果阴性且无症状，则判定PSTVd阴性；若结果阳性或出现症状，则继续进行二级检测。 二级检测阳性并伴有症状时，判定样品带有PSTVd。 大田植株及收获后块茎检测流程： 采用R-PAGE、RT-PCR或实时荧光RT-PCR进行初级检测。 若检测结果阳性且植株有症状，则进行二级检测；二级检测阳性时，判定样品带有PSTVd。 若检测结果阴性且无症状，则判定PSTVd阴性。