【SN商检标准】 国境口岸环介导恒温扩增(LAMP)检测方法第2部分:产毒素霍乱弧菌

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3306.2-—2012
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP)检测方法第2部分：产毒素霍乱弧菌
Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part2:Choleratoxin-producingVibriocholerae2012-12-12发布免费标准bzxz.net
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP)检测方法》共分为4部分：一第1部分：鼠疫杆菌；
—一第2部分：产毒素霍乱弧菌；一第3部分：志贺氏菌；
-第4部分：嗜肺军团菌。
本部分为SN/T3306的第2部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T3306.2—2012
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中国疾病预防控制中心、广州华峰生物科技有限公司。本部分主要起草人：田桢干、左锋、查期、翰志英、陆哗、章琪、方筠、李晓虹、王传现、何宇平、李平、卢钟山、王婷、阀飚、曹以诚、杜正平、陈狗。1
1范围
国境口岸环介导恒温扩增（LAMIP）检测方法第2部分：产毒素霍乱弧菌
SN/T3306.2—2012
SN/T3306的本部分规定了国境口岸检测疑似样本、环境水等样品中产毒素霍乱弧菌的环介导恒温扩增(LAMP)法。
本部分适用于国境口岸产毒素霍乱弧菌的筛选检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求WS/T230—2002临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用WS289霍乱诊断标准
3缩略语
下列缩略语适用于本文件：
Betaine：甜菜碱
Bst酶[BstDNApolymerase(largefragmen]：BstDNA聚合酶（大片段）CT（choleratoxin）：霍乱毒素ctrA(cholera toxin subunitAgene)：霍乱毒素AA亚单位基因
DNA（deoxyribonucleicacid）：脱氧核糖核酸dNTP(deoxyribonucleosidetriphosphate）：脱氧核苷三磷酸EDTA（ethylenediaminetetraaceticacid)：乙二胺四乙酸LAMP(loop-mediatedisothermalamplification）：环介导恒温扩增TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚4生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由通过生物安全培训并具备资质的工作人员检测产毒素霍乱弧菌，所有培养物和废弃物应参照GB19489中的有关规定执行。5防污染措施
防止污染措施应符合WS/T230的规定。SN/T 3306.2—2012
6技术概要
根据产毒素霍乱弧菌的特异性序列基因设计特异性内引物、外引物各一对，或再增加环状引物一对，特异性识别靶序列上的独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，可观查判断结果；另加人核酸显色液，可观察颜色变化判定结果。7
试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。7.1引物：根据产毒素霍乱弧菌属特有的靶序列ct工A基因设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1，内引物2和环状引物1,环状引物2。外引物扩增片段长度：242bp。
外引物1(F3，5'-3')：GCAAATGATGATAAGTTATATCGG外引物2(B3,5-3'):GMCCAGACAATATAGTTTGACC内引物1(FIP,5*-3)：TCTGTCCTCTTGGCATAAGACGCAGATTCTAGACCTCCTG内引物2（BIP，5-3）：TCAACCTTTATGATCATGCAAGAGGCTCAAACTAATTGAGGTGGAA环状引物1(LF，5-3）：CACCTGACTGCTTTATTTCA环状引物2(LB,5'-3')：AACTCAGACGGGATTTGTTAGG7.2DNA提取液：含20mmol/LTris-HCl(pH8.0)、2mmol/LEDTA和1.2%TritonX-100。7.3dNTPs：每种核苷酸浓度10mmol/L。7.4Bst酶：8U/μL。
7.510×ThermoPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl(pH8.8)、100mmol/LKCl、100mmol/L(NH4)2SO,、20mmol/LMgSO.、1%TritonX-100。7.6MgSO..50mmol/L.
7.7甜菜碱：5mol/L。
7.8显色液：浓度为1000×SYBRGreenI。7.9阳性对照：可溯源的标准菌株，或含目的片段的DNA亦可。7.100.2mL和1.5mL塑料离心管。7.11
吸头，配套移液器使用。
仪器和设备
移液器：量程0.5μL～10μ，量程10μL~100μ，量程100μ～1000μ。8.27
高速台式离心机：≥7000g。
8.3水浴锅或加热模块：65℃±1℃和100℃±1℃。8.4计时器。
9检测程序
产毒素霍乱弧菌LAMP检测程序见图1。2
操作步骤
样品制备、增菌培养
待测样品
前处理后的样本、选择性增菌液、培养后的可疑菌株+
细菌DNA提取
LAMP反应
结果观察
传统方法确认
图1产毒素覆乱弧菌LAMP检测程序按照WS289进行样品制备和增菌。2模板DNA的制备
10.2.1总则
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参照WS/T230一2002中5.3样品的处理中的原则制备检测模板，可采用下述方法，也可使用等效的商品化DNA提取试剂盒，并按其说明提取制备模板DNA。10.2.2阳性对照DNA制备
将产毒素霍乱弧菌标准菌株接种于3%氯化钠碱性蛋白陈水（APW)中36℃士1℃培养18h～24h，用无菌生理盐水稀释至约10°CFU/mL～10°CFU/mL（约麦氏浊度0.4），提取模板DNA作为LAMP反应的模板。
10.2.3前处理样本模板DNA的制备对于10.1获得的处理后样本沉淀采用如下方法制备模板DNA：沉淀中加人80μLDNA提取液，混匀后沸水浴10min，置冰上10min；于7000g离心2min，上清液即为模板DNA；取上清液置一20℃3
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可保存6个月备用。
10.2.4增菌液模板DNA的制备
取10.1获得的增菌液1ml.加到1.5ml无菌离心管中，7000g离心2min，尽量吸弃上清液，再按照10.2.3步骤制备模板DNA以待检测10.2.5可疑菌落模板DNA的制备
对于10.1分离到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，再按照10.2.3步骤制备模板DNA以待检测。
10.3环介导恒温核酸扩增
反应体系
产毒素霍乱弧菌LAMP反应体系见表表1产毒素霍乱弧菌LAMP反应体系组分
ThermoPol缓冲液
外侧上游引物（F3）
外侧下游引物（B3）
内侧上游引物（FIP）
内侧下游引物(BIP）
环状上游引物(LF）
环状下游引物(LB)
甜菜碱
BstDNA聚合醇
DNA模板
去离子水
反应过程
工作液浓度
10μmol/1
50μmol/L
umol/l
Opmol/l
50μmol/
10mmol/
50mmol/L
8U/μl
加样量
反应体系终浓度
0.2umol/L
0.2μmol/L
1.6μmol/L
1.6μmol/L
0.8μmol/L
0.8μmol/L
1.4mmol/L
6mmol/L
0.32U/μL
按照表1所述配制反应体系：65℃恒温扩增60min，80℃2min使酶失活，反应即结束。10.3.3空白对照、阴性对照、阳性对照设置每次反应应设置阴性对照、空白对照和阳性对照。10.3.3.1
2空白对照以无菌水代替DNA模板。10.3.3.2
阴性对照以DNA提取液代替DNA模板。10.4结果观察
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在上述反应管中加人2L显色液，轻轻混匀并在黑色背景下观察。显色液优选为荧光染料SYBRGreenI
5结果判定
在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：阳性结果：待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为初筛阳性，对样品的增菌液或可疑纯菌a)
落进一步按WS289操作步骤进行确认后报告结果；阴性结果：待检样品反应管液体呈橙色，则可报告检验结果为阴性。b)
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