【SN商检标准】 山茶花腐病菌检疫鉴定方法

SN/T 3427—2012 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 山茶花腐病菌检疫鉴定方法 Detection and Identification of Ciborinia camelliae Kohn 2012-12-12发布 2013-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：张建成、张慧丽、郑炜、杨翠云、厉艳、封立平、陈先锋。 1 范围 山茶花腐病菌检疫鉴定方法。 本标准规定了山茶花腐病菌的检疫和鉴定方法。 本标准适用于山茶属（Camellia spp.）植物上山茶花腐病菌（Ciborinia camelliae Kohn）的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 SN/T 1157 进出境植物苗木检疫规程 3 原理 3.1 分类地位 学名：Ciborinia camelliae L. M. Kohn，1979。 异名：Sclerotinia camelliae Hara，1919。 英文名：Camellia flower blight。 中文名：山茶花腐病菌。 异名：山茶菌核病菌。 山茶花腐病菌属真菌界（Fungi）、子囊菌门（Ascomycota）、子囊菌纲（Ascomycetes）、柔膜菌目（Helotiales）、核盘菌科（Sclerotiniaceae）、叶杯菌属（Ciborinia）。 山茶花腐病菌通常侵染山茶属（Camellia spp.）植物的花。地理分布和寄主参见附录。 3.2 检疫鉴定依据 以山茶花腐病菌在寄主植物上的症状特征，以及菌核、产孢瓶梗和小型分生孢子的形态特征作为鉴定依据。 4 仪器设备 冰箱、解剖镜（最低10×）、生物显微镜（40×～800×）、恒温光照培养箱、高压蒸汽灭菌锅、接种针、镊子、酒精灯、玻璃盒或塑料盒、纸巾或滤纸、喷雾器、培养皿（直径90 mm～100 mm）、手术剪、手术刀、标签、载玻片、盖玻片等。 5 试剂和培养基 70%（体积分数）乙醇、次氯酸钠、纯乳酸（可添加0.5%甲基蓝）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。 6 抽样 口岸查验进境山茶属植物时，按照SN/T 1157对山茶属苗木进行抽样与取样。 7 检验方法 7.1 现场检验 重点检查样品的花，观察样品的花是否具有符合8.1所述的疑似症状特征。采集变褐、变干或具有任何可疑症状的花，采样数量应尽可能多，至少5朵，并进一步进行实验室检验。 标注品名、数量、生产国、取样地点、取样人和取样日期等样品信息。 7.2 实验室检验 7.2.1 寄主病原物观察 观察花瓣上是否有病斑、菌核、分生孢子座，以及花基部是否形成白色环状菌丝体。 7.2.2 显微观察 潮湿条件下，花瓣上可产生褐色至黑色有光泽的液滴。解剖镜下挑取黑色液滴，以乳酸（可添加0.5%甲基蓝）为载浮剂，在生物显微镜（40×～800×）下观察产孢瓶梗和分生孢子座。 7.2.3 保湿培养 选取无褐变或初侵染但未腐烂的花和花瓣，根据样品大小选择合适的培养皿或塑料盒。盒内铺一层灭菌滤纸，滤纸上放置灭菌毛巾或纸巾，加入无菌水后置于恒温恒湿光照培养箱中，在22℃±3℃条件下进行12 h光照培养。 培养3 d～4 d后，在解剖镜下观察，并按照7.2.2的描述挑取子实体制片，在显微镜下观察。若无明显变化，则继续保湿培养并定期观察。培养3周后仍无变化，则停止培养，并对植物材料进行高压蒸汽灭菌处理。 7.2.4 分离培养 取感病花瓣病健交界处组织数块，用1% NaOCl溶液表面消毒1 min，无菌水冲洗3次后置于PDA平板上，在20℃～25℃、12 h光照条件下培养。 如无新鲜感病组织可供分离，可采用花瓣基部白色菌丝环或菌核代替。待菌落出现后，观察菌落的形态、颜色、生长速率及子实体等培养性状；显微镜下检查分生孢子座、产孢细胞及分生孢子的形态特征。 将疑似山茶花腐病菌菌株转接至新鲜PDA平板进行纯化培养，并保存备用。 8 鉴定特征 8.1 危害症状 主要症状为花瓣变褐和花部坏死。病害首先在花瓣基部出现棕色小斑点，斑点逐渐扩大，并向上蔓延至整个花瓣，扩展速度约为每天1 cm，边缘组织腐烂。 病害严重时，花维管束变黑，组织完全坏死，呈干腐状并脱落。但花的整体结构仍能保持完整，即使整个枯萎花朵受到挤压，花瓣也不易脱落。 环境湿润时，花瓣基部或中心部位产生褐色至黑色、有光泽的小液滴，直径约1 mm。在显微镜下可观察到病原菌产生的相关繁殖结构。