【行业标准】 出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法 第10部分香蕉成分检测 实时荧光PCR法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3729.10-—2013
出口食品及饮料中常见
水果品种的鉴定方法
第10部分：香蕉成分检测
实时荧光PCR法
Identification of fruit species in export food and drink-Part 10:Detection of banana ingredient Real-time PCR method2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
SN/T3729.10—2013
SN/T3729《出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法》共分为以下10个部分：第1部分：草莓成分检测
第2部分：杏成分检测
第3部分：梨成分检测
PCR法；
实时荧光PCR法：
实时荧光PCR法；
第4部分：芒果成分检测
第5部分：木瓜成分检测
第6部分：苹果成分检测
第7部分：葡萄成分检测
第8部分：山楂成分检测
实时荧光PCR法：
实时荧光PCR法；
实时荧光PCR法；
PCR法；
实时荧光PCR法；
实时荧光PCR法；
第9部分：桃成分检测
第10部分：香蕉成分检测
实时荧光PCR法。
本部分为SN/T3729的第10部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本部分主要起草人：张舒亚、叶军、于翠、李富威、刘月明、陈颖、吴亚君、韩建勋。1
1范围
出口食品及饮料中常见
水果品种的鉴定方法
第10部分：香蕉成分检测
实时荧光PCR法
SN/T3729的本部分规定了出具售PCR检测方法。
SN/T3729.10—2013
酒精等精加工食品除外)中香蕉成分的实时荧光本部分适用于果汁，果酱及其他以水果为原辅料的食品中香蕉成分的定性检测。本部分所规定方法的最低检出限（LOD)为1%（质量分数）2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)用于本文件。GB/T6682
分析实验室用水规格
GB/T27403
3术语和定义
实验室质量控制规范
下列术语和定义适用于本文件
香蕉Musa paradisaca
芭蕉科芭蕉属植物
清汁clarifiedjuice
验方法
食品分子生物学检测
经过澄清工艺加工，没有浑浊和沉淀的果汁。3.3
浊汁cloudyjuice
未经过澄清工艺加工，浑浊但未分层和沉淀的果汁。4缩略语
下列缩略语适用于本文件
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）SN/T3729.10-2013
dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）。CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide）。Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethanel。EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)。Taqt水生栖热菌（Thermusaquaticu）。OD：光密度值（opticaldensity）。5方法提要
样品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板，采用香蕉的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象，进行食品及饮料中香蕉成分的检测鉴定，其中以香蕉果肉DNA为阳性对照，以非香蕉来源的DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照。6试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。
6.1检测用引物和探针：见表1。表1引物探针序列
引物/探针
内参照5'端引物
内参照3°竭引物
内参照探针
香蕉5°端引物
香蕉3°端引物
香蕉探针
引物/探针序列（5→3\)
CCTGAGAAACGGCTACCAT
CGTGTCAGGATTGGGTAAT
FAM-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-TAMRATCGTCCCCTATTGGGATGC
GTTTCGGCCTGCGCTTTAA
FAM-TGCACCGAAGCACT-MGB
目的基因
真核生物18SrRNA基因
香蕉线绿体rbeL基因
CTAB提取缓冲液：20og/LCTAB.1.4mol/LNaCI.0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/LNa,EDTA，6.2
6.3CTAB沉淀液：5g/LCTAB.40mmol/LNaCl6.4
三氯甲烷（氯仿）。
异丙醇。
70%乙醇。
蛋白醇K溶液（20mg/mL）。
NaCI溶液（(1.2mol/L)。
6.9TE缓冲液（Tris-ClEDTA缓冲液）：10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。6.10实时荧光PCR反应混合液：12.5μL反应体系包括：1U~2U的Tag酶、1×PCR缓冲液、2.5mmol/L~4.0mmol/L的Mg+、0.2U~1U的UNG酶、0.2mmol/L的d（A，C,G）TPs、0.2mmol/L~0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料（某些荧光PCR仪不需要ROX校正）。2
7仪器设备
实时荧光PCR仪。
7.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。7.3恒温水浴锅。
7.4离心机：离心力≥12000g。
SN/T3729.10—2013
5微量移液器：0.5μL10μL，10μ~100μ，20μL~200μL200μL~1000μL。7.6
研钵及粉碎装置。
涡旋振荡器。
7.8pH计。
7.9天平：感量0.01g。
7.10量筒：感量50mL。
7.11真空冷冻干燥机。
8检验步骤
8.1DNA提取
8.1.1清汁
将果汁样品上下颠倒均勾。取约30mL果汁至一洁净培养皿中，抽真空冻干：称取0.2g冷冻干物质至一洁净50mL离心管中，然后加人5mLCTAB裂解液，65℃孵育1h.间期不断混匀几次：8000g离心15min，取1mL上清液至1只洁净2.0mL离心管中。然后加人700μL三氯甲烷，剧烈混匀30s，14500g离心10min，取650μL上清液至洁净2.0mL离心管中，加人1300μLCTAB沉淀液，剧烈混匀30s，室温静置1h；14500g离心20min，弃上清液，加人350μL1.2mol/LNaCl，剧烈振荡30s再加入350μL三氯甲烷，剧烈混勾30s，14500g离心10min：分别取上清液320L，加人0.8倍体积异丙醇，混匀后，-20℃1h，14500g离心20min，弃上清液，加人500μL70%乙醇，混匀后，14500g离心20min，弃上清液，晾至风干，加人30μL双蒸水溶解，一20℃存备用。8.1.2浊汁
将果汁样品上下颠倒均匀。取约30mL果汁至一洁净离心管中，8000g离心10min，去上清，加入5mLCTAB裂解液，65℃孵育1h，其余步骤同8.1.1。8.1.3固体样品
称取研磨后的样品500mg于50mL离心管中，加人5mLCTAB裂解液，65℃孵育1h，其余步骤同8.1.1。
2DNA浓度和纯度的测定
使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A2m。DNA的浓度按照式（1)计算。当A260/A280比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增。3
SN/T3729.10—2013
式中：
c=AXNX50/1000
DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL）A—260nm处的吸光值；
核酸稀释倍数。
实时荧光PCR扩增
实时荧光PCR反应体系
见表2。此内容来自标准下载网
表2实时荧光PCR反应体系
2×实时荧光PCR混合液
正向引物（10μmol/L）
反向引物（10mol/t）
探针（10μmol/L)
DNA模板（20ng/μL~100
实时荧光PCR反应程序
50℃2min95℃10min95
质量控制
601min-40个循环
空白对照：无荧光对数增长
相应单
阴性对照：无荧光对数增长，相应的值一40反应体系中的终浓度
0.4 μmol/L
0.4μmol/L
0.2pμmol/L
阳性对照：有荧光对数增长，直荧光通道出现典型的扩
广增曲线，相应的Ct值<35.0
内参照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值<35.0。
结果判定与表述
结果判定
如Ct值≤35，则判定被检样品阳性。如Ct值≥40，则判定被检样品阴性。（1)
如35结果表述
样品阳性，表述为检出香蕉成分”。2样品阴性，表述为“未检出香蕉成分”10.2.2
检测过程中防止交叉污染的措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403的规定执行，SN/T3729.10-2013
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