【国家标准】 乳及乳制品卫生微生物学检验方法 第12部分：单核细胞增生李斯特氏菌检测与计数

中华人民共和国理入境检验检疫行业标准N/H2552.12---2010
及乳制微生物学检验方法
第2部分：单核陶增李斯特氏菌
松计教
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S/ 2552.12--2010
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发物学检验法
第開分：萬格增生斯特菌
SN/12552.12-2010
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6.2m:er肉汤见附费A中第A童。
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3/ 2532. 12--2010
4说备粮材料
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4.2们游水游稻.02
43温路养箱-
4.5生物品微镜..o1co
微能器
4.8商遇冷冻离心机股离心力准？的4，制冰机
4. 10R仪
4.11凝胶电泳装置及成像系统
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主：活等用效的标能咪市来目
完性检调方法
5.1预增菌
单细增李斯特民勒格视科室
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预增原将顾尊培系物按，人变图券中升行增商，同时接照3的方法将增的培养物划线接下体选海片学行增菌
取0预服增养物转摄你养482
5.3分离培养
5. 3.1划线援种
职5.中的预增商整物减：？中的#希线接种下质体造摔培养品AA和A平饭1下1！音美2比+点实4速人明显或不典型，继续培养至483h周观擦结果
3.2蘭游观察
单核用地牛多斯称长菌在A「：：典型商群称征为菌游是斑色：周阴有不透明的润：路教483是闻客两平周册法：的单按知胎限特民南降本是设我保，活有单核所增学地特民菌在AA装的中州广以中源注：缩举运斯特氏司准A（的核配通特区离相议，htt
科，可按限
5..3确测-1
尚试剂
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刘单头培养HAXAi
SN/1 2552. 12--2010
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一广学有设
单精谢增宝期活检测醒序
询达验
单核细胞增专期低菌在换A主牛主：3#，典型内落品即或阅，#程的工的的充有周图有然色的林湖：在落举81，“3层，阁客露量惠黑包：并格有绿包光泽，案费中心陷，名约2mn在有，落质朋熟色年网大
5、鉴定
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链增将届，叫以按照我鉴：的以核的检测密净进行擎。http:

S1/T 2552.12--2010
5. 4. 2 既限方法
5.4.2、1網菌培新
从 5: 中的 TSA-YEF 英 *国移*1 mL 1S比YE中+ 36 C1 C￥h--2 1
5.4, 2.2细菌14的提取
提政为然见附录中的第（。
5. 4.2.3度扩增
R扩增体利扩普条件见幕录B中的第章，防止交叉污案指施参见附录。5. 4. 2. 4pC表质控对照
每次进行民求检测时额聚改空周熙,阴性对和准南对限用单核细跑增牛李斯特荣标维菌株展的人性对照.用件菌或链球菌标准所性株提最的DVA作限性照。用灭荫权蒸水件代奠想件对照。5.4.2.5通胶电泳检测P时场
重泳缓冲液配制「光的琼能源起法照意源舒化店冷动至大布人限化乙资液，其终报度为0.5/m将R产群缓冲液混合加人加样孔中并在其仙孔中加人DA分子星标记，以0V～10：V的#压进行脉，最厚用凝胶成像系统观察结果并分折保存品录5, 4. 2, 6结果判断
划荣单核细跑增作李特武菌际准间“R部物山漾同时山圳2和8p两系段英诺先本斯特无茵标雅将惊PR扩增产新只出现要的开段：非李斯特萄游的标隆菌称和空自对脏限扩增心物点激后木出现口的段，测试验成立，否则试验失败·成该亚做。果得检样品划增产电泳同时品期7双和938b两条肝度刚到建为阳性缩，对性结果再按烈在小的检测程宇出经得到认可的声求的试制盒鉴在授街给果。果待检品R扩产嘴中中成：十的条片段或两条片段购不出姚，则判定为阴性结柴+并告待检偿叫市无检单核亲艳学斯特比肉5.4.3牛物学特征性鉴定方满
5、1. 3. 作革差氏染色
将541中纯分离养的细药制火常！结品紧染色mm水洗，门用草低焕腋染1min，水流.%法粘悦血小路沙条年复车系洗，干炼镜赖，本斯特氏菌为中长阳性短菌。
54.3.2过氧化氢斌骑
在活学的载航片工滴加湖双家生济：中纯分离培养的细菌混合3为双水溶液中，季斯守民尚会：生浪，民微商具生成应雪品伙伴欧t
.4. 3.3试验
5N/T 2552.12---2010
将1中SA1纯分必密择的组测摄码动培减中，下1培养学斯特保力在动基宁典鼎的妆，果状不明显川以继统养再划察结案，动力诚验的A种做达是净5.1A！纯分离培肉细菌接种于TSYF中，了2C1增养8h~2当培养基心弹注时收，路活净的就玻片，盖盖嫂片在显微镜下观察下斯特武菌量逗情然并做阐转读部，,A.3.4糖发薛试验
将4中纯分离体养的纠菌接在！小养18h降该细培举物分别燃种！木鼠李发基，平“界8！后观然结果。被你爱表明为性应，第颜也不变化，可以继缕观益5后判实续来。5. 4. 3. 5溶如试鉴
将血平板分成者1个小格，将！1，1中AH绝分离培养的细菌穿刺接汀面平救，您个小格接种一次，同H接种单核细服磨汁中期特氏菌，两尔李斯韩氏菌、绵羊李斯特氏韵和英谐克李斯特医两款观菌株作对照：单核圳增李斯特以缅会出现穿小的，清晰透明的学济血环，西尔中斯特医前会出现数弱的溶血环，绵羊李斯特识菌会出现人的子率血环，英诺克中斯特民菌不出跳济而环，5.4.CA试验
ereus和乌红康菌（Rhodrmru，ui）划在单而乎极分用金英谢商球菌（Sua恶务紧，两条竖线行护对，存两多心然产画带停到线按帅待检菌株，产小与两系怪然间相1\2mm在尚--极叫尚时刻线接种学车得教潮殊，同剂紧照同样的方送将单核细鹏增曾出杀斯特民面羊个斯特菌英诺克李斯出函标社谢株也划线接了同平概上。将而平板置51增养1片观察结只。单军胸心生卡斯特氏菌自常派金黄色球菌处山现3游血理强区城，该区城较小大约加虹：单心斯特民彭位近过经球菊处山现较大的台溶m增盟区虚，该区城是箭头次，大約机如界江出激链小的微弱的路血区城则判为阴性反应，语究事护民菌不出现3率而增强区：流网器：该物不作为带观检测验中必须进行的检测非殊可求试验舒要进行择
单换细胞带牛学斯民成
牢的率强区
较天的-溶血啥斯这期
员诺克李斯情民案
原符民
法：两条照线分别代表马红球者（1种金资负谢陷）到斜线区装示溶血增单；点然固影的学金燃的带需球影响的区域，窗？AM证验神实次与结果求意图http
SN/T 2552.12~-2010
5、4.3.7整定结果的说阴
以菌形态和生化特征方此大深与等压纽道！沟，些是桌毕拿斯特菌离属中个所特有的：睿李斯特氏菌种门学鼎特科素表
中文南名
瑞发陈试赖
单炫织胞增生牵斯将菌
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英诺克空渐特民菌
缔今斯特氏南
西斯特民菌
威医斯特医园
裕民李斯特汇索
数医学斯衔茶
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L. tshircr
游：没应不定+原虑微的！性度
注：有单核纸胞增生至斯得每离求，小发：溶为A
5. 5质按对照
CAMF试验
金黄色衡
怡恐馈
幻球菌bzxz.net
每欧检验均节川标淮菲菊欲（中密原增空传商）和标阳性葡株（如拆南波链球萌作质控对照。接照】的步对待检样！领增两前前围时方政渐份培养基分别接种标雅间性菌株和标旗调性菌模接种景：10（·（）并安激检测税序逊行同少试验。.3缩果报告
5.6！阳性结果报代：检山单核缩点增4密斯高长离5.6.？阴比结果报凸太检出单该的均准→斯转1肉，药计数方法
6. 1 样品的制备与稀释
死菌段25得格样人到的肉汤中质，202℃复：h5mm该最初祥星教件%：1伴然降糕率：然收孩样品想凌10.加人到90ml的不加添加剂的#肉游中到惠价中品偿择液：必费时按照间样的方送续避行10低条列释。
6. 2接种与培养
将每个稀释度的样品瘤释液接利2会（版：街中板度种0.1m并用灭菌的涂南涂布均勾，待表洲干后剧转乎极厂37培案：：欢结梦：来菌落不巩品或不典型继续培养5
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8h3店年观漂精集
法：对单核维照游穿民肉款微车典持：品华路可以分州职「徐布两个人A人平版：径）成将4：m分改会个：：+小：内mA0A中热主计数时按用个平最有的，似菌落的计数
按照532的方法期行菌将认，品购含款特情的南落总微1板的极进行维商计妆，并保密平板洲证，理验学6.4鉴定
就收微似季斯特医菌的有落总数门椒的中被，舒个华被挑职个南雍灿乐可就菊蔽数生个，则将其生非求股按限，的摄作讲鉴效性可以孕其他得认的商业化试剂盒谢行警
总概个平概上单核纳泡增生斯将南阅滋球“的计算鉴定平用式（算每个7极：华核河有生全斯分民的的荣落数：.(E)
人平首核细股兜生命期中：需密数“所逃教的尚薪中验家为单极非非生心质街武案的颜落微；A“舞个平板所挑最肉函带数：
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6格品中单核细腔增生斯特医的教件8！于5单核细购湾实求自比济教，板0的样品用式2计带动提告：n.r
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第个橘释度保科平尚妆
第二新释族像品平税的致：
南格数?极种激棉祥心教
热件器票用两位有效微本（：0，单位为（/m）（
862对用最划样品缔整滋楼钟拍1丫核销能地中本装天菜菌格激/板15印：的样品用估等利最管
品中单核脑增生特净微筑街
用创样品稀滋液接种品纳个学核增孕斯特民菌菌落数平购信最初的鲜精滚的都彩信教：
每个平极接种的液体你积。
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33/1 2652.12--2010
投告结果用N估资借表示。单位为m）)63对下用最初样品稀辉液接种的平极上：职可凝菌辫的样品用式（4）装结果和报告：武中：
N“-样品4单核细跑增李斯格商件值gCFU/m最韧样品稀释液的稀择信数：
每个了板接神的被体体积：
报告站果用心
6.7质控对照
次检验均需英片标准阳性商袜单核纠跑增生李斯特氏菌）和标滩阴性菌株（如！杆菌或链球菌）作质控对照！，按照5。1中的方泌对检润而进了品制备和稀释的同府：也同时将稀释肉汤分预接标准件菌株和标雅阴性南殊（接种量为/100（F/瓶）并接照检测程序迅行间步诚验。7索全要求
为了确保试验室工作人员的安金和继康，建议在二级车物安全试验室进行单核细胞增生李斯特民菌检测，并其行实际操作技能的微生物学专家负责管理，对所有细菌培养物都应该进行谨慎处现，另外然议孕不以来单核范半特法并和检洲作http
Hialt uresur 肉汤
基础熔养基
A.1、1. 1
淡化造广陈
肉没盘
阴“钠
磷酸二氨钾
蒸馏水
1000 rmt.
鄂N/2552.12—2010
将1连各成分溶水后加热溶解.调用低率7.2上0.2.分装后于121火菌15min备用。2，1.2意化理溶痛
店，1.21成分
氨化铆
蒸馏水
.1.2.2制背
将氨化抑落解下热留水中过然阴氮繁啶酮酸钠黏溶液
A. 3. 1 成分
啶酮酸钠盐
0. 05 mo1/1.氢氟化钠溶液
A,1.3.2制骼
将禁密限铜盐济解工级创化南密波小过总除htt
WN/T 2552.12- -2010
A.1.4粘酸吖啶黄紫溶滤
A. 1.4. 1 成分
盐酸吖陡菌素
蒸馏水
4. 1.4. 2 制备
将盐滋吖啶草素溶解燕溜本中，密除A，1.5控檬酸铁铵溶液
A.1.5.「成分
榨檬腰铁铵
蒸馏求
A、1.5.2制备
将柠檬鞍铁铵溶解二蒸馆水中刘油除肉A.E健用（完全）培养基
A.1.6.1感分
基础培养基(A，1)
氯化锂辫液1A，1.2)
蔡啶酮酸钠盐济液（A3)
盐吖肯素溶液（A、。)
柠像酸铁铵溶腋（A、3)
.1.6.2制备
1） t
在嘴形游按照需用长将A，！·济液汇人。。「落液小.2rx肉汤
础境养基
A2.2氮化钾溶液
噻酸钠盐溶液
.？4献酸吖黄嘉溶液
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