【行业标准】 进出口动物源性食品中二硝托胺残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2453—2010
进出口动物源性食品中二硝托胺残留量的测定
液相色谱-质谱/质谱法
Determination of zoalene residues in foodstuffs of animaloriginforimportandexportLC-MS/MSmethod2010-01-10发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2010-07-16实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
进出口动物源性食品中二硝托胺残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法
SN/T2453—2010
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
2010年5月第一版
印张1.25字数30千字
2010年5月第一次印刷
印数1—1600
书号：155066·2-20746定价21.00元http：//foodmate.net前言
本标准的附录A、附录B和附录C均为资料性附录本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人：刘永、吴岩、杨长志、康庆贺、王雪飞、翰文东，本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。http：//foodmate.netSN/T2453—2010
1范围
进出口动物源性食品中二硝托胺残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法
SN/T2453—2010
本标准规定了动物源性食品中二硝托胺的制样和液相色谱-质谱/质谱检测及确证方法，本标准适用于动物肉、肝脏、肾脏、牛奶中二硝托胺残留量的测定。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方面研究使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3方法提要
用乙睛提取试样中的二硝托胺，提取液经中性氧化铝固相萃取柱净化，洗脱液浓缩后定容，液相色谱-质谱/质谱仪测定，外标法定量4试剂和材料
所有试剂除特殊注明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1乙睛：色谱纯。
4.2二氯甲烷。
4.3甲醇。
4.4丙酮。
4.5氯化钠。
4.6无水硫酸钠：经650℃灼烧4h，冷却后在干燥器中储存备用。4.7无水硫酸钠柱：用内径约为1.5cm的下部收口玻璃管，收口处填装少量玻璃棉，然后填装无水硫酸钠.高度约为1.5cm左右。
4.8二氯甲烷-丙酮（7+3）溶液：量取100mL丙酮，用400mL二氯甲烷稀释。4.9甲醇-丙酮（8+2）溶液：量取100mL甲醇，用400mL丙酮稀释。4.10乙睛-水（4+6）溶液：量取400mL乙睛.用水稀释至1000mL过0.22μm微孔滤膜4.11乙睛饱和的正已烷溶液：20mL乙中加人100mL正已烷，充分振荡后，静置分层，取上层正己烧层备用
4.12中性氧化铝固相萃取柱：1000mg，6mL，或相当者。使用前分别用10mL丙酮、10mL二氯甲烷-丙酮（7+3)溶液预处理，并保持柱体湿润。注：中性氧化铝固相萃取柱开封后应保持干燥。4.13标准物质：二硝托胺纯度大于98.0%.CH,N，O,，CAS:148-01-6。4.14标准储备溶液：准确称取按其纯度折算为100%质量的二硝托胺标准品0.010g，用乙睛溶解并定容至100mL，浓度相当于100μg/mL。储备液在0℃~4℃冰箱避光保存，可使用6个月。4.15标准中间溶液：准确量取标准储备溶液1.0mL，用乙睛-水（4十6）溶液溶解并定容至100mL，浓1
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度相当于1.0ug/mL，在0℃～4℃冰箱避光保存，可使用1周，4.16标准工作溶液：根据需要用1.0mL适当浓度的标准工作溶液溶解空白样品浓缩残渣，配制成适当浓度的标准工作溶液，标准工作溶液应当天配制。5仪器和设备
5.1高效液相色谱-质谱/质谱仪：配电喷雾离子源（ESI)或相当者。5.2天平：感量0.01g。
5.3分析天平：感量0.1mg
5.4固相萃取装置。
5.5氮吹仪。
旋涡混匀器。
5.7均质器。
5.8离心机。
5.90.22μm微孔滤膜。
6试样的制备与保存
固态样品取有代表性的约200g，均分成两份作为试样，分别装人洁净容器，密封并做好标识，于一18℃冰箱内保存，液态样品取有代表性的约200mL，均分成两份作为试样，分别装入洁净容器，密封并做好标识，于0℃～4℃冰箱内保存。在抽样和制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生二硝托胺含量的变化7测定步骤
7.1提取
7.1.1固态高含量样品
准确称取0.5g试样（精确到0.01g）于50mL离心管中，加人2g无水硫酸钠、20mL乙腈，用均质器以10000r/min均质1min，以4000/min离心5min，上清液转移至50mL具塞离心管中，样品用10mL乙睛重复上述提取、离心操作，合并两次提取的上清液，加入经乙睛饱和的正已烷溶液10mL，用旋涡振荡器混勾2min后，以4000r/min离心3min，弃去上清液，下层过无水硫酸钠柱，转移至鸡心瓶，浓缩近干后待净化。
7.1.2固态低含量样品
准确称取5.0g试样（精确到0.01g）于50mL离心管中，以下同7.1.1。7.1.3液态样品
准确量取5.0mL试样于50mL离心管中，加人2g氯化钠、10mL乙睛，旋涡振荡3min，以4000r/min离心5min，取上清液5mL于15mL离心管中，加人经乙睛饱和的正已烷溶液10mL，用旋涡振荡器混匀2min后，以4000r/min离心3min，弃去上清液，下层用氮吹仪浓缩至近干，待净化，7.2净化
残渣用2.0mL二氯甲烷-丙酮（8+2)溶液溶解，以1mL/min~2mL/min的速度过中性氧化铝固相萃取柱，再用2.0mL二氯甲烷-丙酮（7十3)溶液分两次洗涤浓缩瓶，过中性氧化铝固相萃取柱，弃去流出液，待上样液流出后，用10mL甲醇-内酮（8十2）溶液洗脱，洗脱液于氮吹仪浓缩至近干，用1.0mL乙睛-水（4+6)溶液溶解残渣，经0.22um滤膜过滤，供液相色谱-质谱/质谱测定。7.3测定
7.3.1液相色谱条件
a）色谱柱：Cis1.7μm，2.1（内径）X50mm，或相当者；2
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流动相：乙睛：水一4：6：
流速：0.25mL/min或根据仪器条件优化：d）
柱温：30℃；
进样量：5μL。
质谱条件
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：负离子；
检测方式：多反应监测（MRM)；其他质谱/质谱参考条件参见附录A中表A.1。d)
7.3.3液相色谱-质谱/质谱测定
7.3.3.1定量测定
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根据样液中二硝托胺的浓度大小，选定峰高相近的标准工作溶液，标准工作溶液和样液中二硝托胺的响应值均应在仪器的检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参差进样测定，在上述色谱条件下，二硝托胺的参考保留时间约为0.86min，标准溶液的多反应监测色谱图参见附录B中图B.1。7.3.3.2定性测定
在相同的试验条件下，样品与标准工作液中待测物质的质量色谱峰相对保留时间在2.5%以内，并且在扣除背景后的样品质量色谱图中，所选择的离子对均出现，同时与标准品的相对丰度允许偏差不超过表1规定的范围.则可判断样品中存在对应的被测物。使用定性液相色谱-质谱/质谱时相对离子丰度最大允许偏差表1
相对离子丰度（K)
允许的最大偏差/%
空白试验
除不加试样外，均按上述操作步骤进行。9结果计算和表述
20K<50
10用数据处理软件中的外标法，或绘制标准曲线，按照式（1）计算样品中二硝托胺的含量。X
式中：
-试样中待测组分含量，单位为毫克每千克（ug/kg）；由标准曲线面得的样液中待测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）：V—样液最终定容体积，单位为毫升（mL)；m
最终样液所代表的试样质量，单位为克（g）。10测定低限、回收率
10.1测定低限
本方法二硝托胺测定低限为5ug/kg。10.2回收率
回收率试验数据参见附录C中表C.1。htwwW.bzxz.Net
K≤10
.（1)
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串联质谱条件：
电离方式：ESI-；
毛细管电压：3.0kV；
源温度：110℃；
去溶剂温度：350℃；
锥孔气流：50L/h；
去溶剂气流：550L/h；
附录A
（资料性附录）
串联质谱条件1
碰撞气：氩气，碰撞气压0.33Pa（3.30×10-3mbar)；监测模式：多反应监测，多反应监测条件见表A,1。表A.1多反应监测条件
化合物
二硝托胺
a离子用于定量。
母离子
子离子
驻留时间/s
锥孔电压/V
碰撞能量/eV
1）非商业性声明：表A.1所列参数是在WatersQuattroPremier质谱仪上完成的.此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试采用不同厂家或型号的仪器。http：//foodmate.net附录B
（资料性附录）
标准样品色谱图
二硝托胺高效液相色谱-质谱/质谱色谱图，见图B.1。STD
Frxla 36
Enxta-36
Erxta-36
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04-lan-200g
10:27:40
MRM oJ 2 Ccharrnels lis
224. 34-181.21
.+,+/min
MRM ul 2 Channls TS-
224. 34 >151. 16
MMof Chamnes
二硝托胺高效液相色谱-质谱/质谱色谱图http：/
/wwurfoodmate.net
t/rmin
SN/T2453—2010
添加回收率见表C.1。
食品名称
附录C
（资料性附录）
添加回收率
添加浓度
添加回收率（n=10）
平均测定值/
(mg/kg或mg/L)
(mg/kg)
平均回收率/%
http：//foodmate.net相对标准偏差/%
Foreword
AnnexA,annexBandannexCofthis standardis informativeannexesSN/T2453—2010
This standard was proposed by and is under the charge of China National Regulatory Commission forCertification andAccreditation.The standard was drafted by Hei longjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of the People'sRepublic of China.
Themaindraftersofthis standardareLiuYongetal.This standard is a professional standard for entry-exit inspection and quarantinepromulgatedfor thefirst time.
ht
SN/T2453—2010
Determinationof zoaleneresiduesinfoodstuffs ofanimal originfor import and exportLC-MS/MS method1
This standard specifies the methods of sample preparation and determination by liquid chromatographymassspectrometryofzoaleneresidues infoodstuffsof animal originThis standard is applicable to the determination and qualification of zoalene residue inanimal-derivedfoods including pork,poultry and their liver,kidney.2Normativereferences
The following normative documents contain provisions which,through reference in this text,consti-tute provisions of this national standard. For dated references,subsequent amendments to,or revi-sions of,any of these publications do not apply. However.parties to agreements based in this nation-al standard are encouraged to investigate the possibility of applying the most recent editions of thenormative documents indicated below.For undated references,the latest edition of the normativedocumentreferredtoapplies.
GB/T6682Waterforanalyticallaboratoryuse-Specificationandtestmethods3Principles
The residues of zoalene residues in the test sample are extracted with acetonitrile,n-hexane is usedto remove lipid soluble matters.The test sample are cleaned-up with AlzO,solid-phase extractioncar-tridges.After being concentrated,the residues are dissolved volume with Acetonitrile-water,and de-termined by liquid chromatographymass spectrometry with electrospray ionization and triquadruplemassspectrometer.quantifiedbyexternalstandardmethod.4Reagentsandmaterials
Unless otherwise specifiedall reagents should be of analytical grade,Water is the first grade waterprescribedbyGB/T6682.
合品伙伴区
4.1 Acetonitrile:HPLC grade.4.2Dichloromethane
Methanol.
Sodium chloride.
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Sodium sulfate:Beheat in650 4h,then coolingto room temperature in desiccator4.6
Sodium sulfate column:Be used glass tube of bottom contraction and filled 1.5 cm sodiumchloride
4.8Dichloromethane-acetone（7+3）) solution:100 mLacetone diluted to 400mL with dichloromethane
4.9Methanol-acetone (8+2)solution:100 mLmethanol diluted to 400 mL with acetone.4.10Acetonitrile-water（4+6)solution:400mLacetonitriledilutedto 1000mLwithwater4.11 n-hexane saturated with acetonitrile:Add 20 mL n-hexane into 100 mL acetonitrile,mix adequately,thenwaitfordelamination separation,usethesubstratelayer4.12Al,O,SPE cartridges(6 mL,1000mg)or equivalent:Pretreat the cartridge with 10 mLace-tone,1o mLdichloromethane-acetone(7+3)solutionbeforeusing,andkeepthecartridgewet.4.13Standards:Zoalene.purityshouldbenolessthan98.0%.4.14Stock standard solution:Dissolve0.010gzoalenewith acetonitrile in100 volumetric flask andthe concentration of standard is 10o μg/mL.The solution should be stored at the temperature 0℃~4℃ for morethan sixmonths.
4.15Intermediate standard solution:Add 1.0 mL stock standard solution to a 100 mL volumetricflask and dilute to volume with acetonitrile-water(4+6)solution.The concentration of intermediatestandard solution is 1 μg/mL.The solution should be stored at the temperature 0 C~4 for morethan one week.
4.16Working standard solution:According to the requirement,dilute 1.0 mL intermediate stand-ards solution with blank matrix extraction solution to proper concentration.The solution should beprepared just before using
合品伙伴
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