【商检行业标准(SN)】 进出口危险化学品安全试验方法 第4部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2497.4—2010
进出口危险化学品安全试验方法第4部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验Test method of import and export dangerous chemicals-Part 4:Saccharomyces cerevisiae mitotic recombination assay2010-03-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
数码防伪
2010-09-16实施
SN/T2497《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为29部分：第1部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成(UDS)试验；第2部分：空斑形成细胞(PFC)试验；第3部分：大型涵繁殖试验；
第4部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；第5部分：率丸细胞UDS试验；
第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；第7部分：小鼠耳肿胀试验；
第8部分：脂窝淋巴结试验；
第9部分：血清溶血素测定试验；第10部分：T淋巴细胞增殖功能测定试验；第11部分：种系突变试验；
第12部分：单细胞凝胶电泳分析试验；第13部分：荧光原位杂交试验；第14部分：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；第15部分：PCR-SSCP实验；
第16部分：Western-Blot实验；第17部分：哺乳动物行为毒理学试验；第18部分：DNA加合物的检测方法；第19部分：NorthernBlot实验；第20部分：Bradford法测定蛋白质含量；第21部分：琼脂糖凝胶电泳试验；第22部分：DNA的Tm值测定方法；第23部分：细胞器的分离实验方法；第24部分：细胞免疫功能体外检测方法；第25部分：体液免疫功能试验；第26部分：巨噬细胞功能试验；第27部分：流式细胞术检测凋亡；一第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；第29部分：生化需氧量（BOD)测定。本部分为SN/T2497的第4部分。
SN/T2497.4—2010
本部分修改采用经济合作与发展组织(OECD)化学品测试指南NO.481《酿酒酵母有丝分裂重组试验》，其有关技术内容与上述方法完全一致，在标准文本格式上按GB/T1.1--2000做了编辑性修改。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。木部分负责起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国湖南出人境检验检疫局。
本部分主要起草人：熊中强、王利兵、彭梓、张园、赵琢、韩伟。本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。I
1范围
进出口危险化学品安全试验方法第4部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验SN/T 2497.4—2010
SN/T2497的本部分规定了进出口危险化学品进行酿酒酵母有丝分裂重组试验的试验原理、试验程序和试验结果。
本部分适用于判定进出口危险化学品能否引起真核微生物酵母的有丝分裂重组。2术语和定义此内容来自标准下载网
下列术语和定义适用于本部分。2.1
有丝分裂交换mitoticcrossing-over基因之间DNA片段的交换(通常在一个基因和其着丝粒之间），导致交互的产物。2.2
mitoticgeneconversion
有丝分裂基因转换
在一个基因内序列的信息单向转移，主要导致非交互产物。3原理
3.1利用酿酒醇酵母（Saccharomycescerevisiae）的某些菌株从杂合等位基因变为纯合等位基因时，菌株的一些表现性状及生长特性的改变来检测受试物是否引起了真核微生物醇母的有丝分裂重组。有丝分裂重组可以在酵母基因之间及同一基因内发生，前者称为交换，后者称为转换，3.2试验中有丝分裂的交换是通过杂合菌株中产生隐性纯合子的菌落或子菌落证实的；而有丝分裂转换是通过在同样的基因上携有两个不同的缺陷型等位基因的营养缺陷型杂合于菌株中产生原养型恢复体证实的。
3.3利用二倍体酿酒酵母菌株D，在选择性培养基中生长的特性检测有丝分裂基因转换。ade2-2，ade2-1trp5-12和trp5-27是ade2和trp5位点上的异点等位基因。这些等位基因进行有丝分裂基固转换，产生携带一个野生型等位基因的原生型菌落，这些菌落能在缺乏色氨酸（trp)或腺嘌呤的选择性培养基上生长。
3.4酵母菌株的有丝分裂交换可通过观察Ds或D，菌株菌落的颜色变化（产生红色或粉色的纯合子有丝分裂交换)或观察D，菌株产生放线菌酮抗性(cyh*2)在含放线菌酮的培养基上生长来检测。4试验程序
4.1试验方法
4.1.1最常用的苗株为二倍体D。、D,、D,和JD，菌株，所用的传代的培养菌株的自发有丝分裂重组频率应在可接受的正常范围内。
4.1.2在试验的不同阶段选用适当的培养基（YEPD,SMM,SCM及选择性培养基)培养试验菌株，以测定其存活率及有丝分裂重组频率。4.1.3细胞应在有和无外源性哺乳动物代谢活化系统的情况下染毒，最常用的代谢活化系统是啮齿类动物肝脏制备的S9混合物。
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4.2受试物准备
4.2.1受试物、阳性对照物应溶解于水或适当的赋形剂中。4.2.2受试物溶液临用前新鲜配制，溶剂的终浓度应对细胞的活力和生长特性不产生显著影响。4.3剂量与分组
4.3.1至少应设5个不同的受试物有效剂量组。4.3.2剂量范围根据细胞毒性及受试物的溶解度来确定，最低剂量应对细胞发育能力无影响。易溶解的无毒受试物的接触水平应根据受试物的具体情况来定；有毒化学物的最高试验浓度应不使细胞存活率低于5%~10%。
4.3.3每次试验应设阴性对照，包括空白和溶剂对照；阳性对照一般用甲基磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、4-硝基唑啉-N-氧化物或环磷酰胺作阳性对照物。对照除不加受试物外，其他条件与试验组完全相同。4.3.4对于有丝分裂基因转换产生原养型试验和存活率试验，每个浓度水平应至少用3个重复平板：对于有丝分裂交换产生隐性纯合子试验，应增加重复的平板数以得到定够的菌落数。4.4试验步骤
4.4.1通常用液体试验法处理静止期或生长期酿酒酵母细胞，首次实验应该用生长期细胞进行。将细胞（1～5)×10″个/mL于28℃～30℃接触受试物18h。在有代谢活化的试验中应加入足量的哺乳动物代谢活化系统。
4.4.2细胞经离心、洗涤并接种于适当的培养基。于28℃～30℃避光培养4d～7d后，对平板存活率和有丝分裂重组诱导进行计算。4.4.3用于检测有丝分裂交换，产生红色和粉红色纯合子菌落的平板应在计数前于4℃再存放1d~2d，以产生适当的含色素菌落。4.4.4利用酵母进行试验的结果都应进行独立的重复试验，以增加结果在统计学方面的有效性。5试验结果
5.1结果处理
5.1.1以表格形式记录重组率测和存活率检测中试验组和对照组每个平板的菌落数、重组体数。5.1.2计算各组的菌落、重组体均数、标准差及重组率和存活率。5.1.3用适当的统计学方法对试验组和对照组的重组率均值的差别进行显著性检验，并在可能时计算受试物浓度与重组率的剂量相关关系。5.2结果评价
5.2.1重组体率随受试物剂量增如而增高并具有统计学意义，或至少在一个剂量水平中出现可重复的并有统计学意义的重组体率增高，即可判为阳性结果。5.2.2未出现上述两种情况，则认为该受试物在本试验系统中的结果为阴性。5.3试验报告
试验报告应包括以下内容：
受试物、溶剂的理化特性，受试物配制方法；菌株种类、基因型、来源，菌株鉴定方法及结果，生长条件及培养基制备方法；阳性对照物的选择及制备，溶剂对照的设置；处理条件和情况的措述，包括染毒浓度的选择、染毒持续时间、终止处理的方法；每个平板的重组体菌落、存活菌落计数，各组重组体率平均值及标准差；显著性检验及相关计算结果；
结果的评价。
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进出口危险化学品安全试验方法第4部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验SN/T2497.4—2010
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开本880×12301/16
印张0.5
字数6千字
2010年5月第一版2010年5月第一次印剧印数11600
书号：155066·2-20924
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