【国家标准(GB)】 畜禽细胞体外培养与冷冻保存技术规程

ICS65.020.30
中华人民共和国国家标准
GB/T24863—2010
畜禽细胞体外培养与
冷冻保存技术规程
Technical regulation of farm animals cell culture and cryopreservation2010-06-30发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2011-01-01实施
本标准由中华人民共和国农业部提出。前言
本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274)归口。本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所本标准主要起草人：关伟军、马月辉、李向臣、李晗、闫雷、赵倩君、宫雪莲GB/T24863—2010
1范围
畜禽细胞体外培养与
冷冻保存技术规程
本标准规定了畜禽体细胞保存方法。本标准适用于猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅等畜禽细胞体外培养与保存。2规范性引用文件
GB/T24863—2010
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括斯误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。：分析实验室用水规格和试验方法GB/T6682
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
体细胞体外培养
invitrosomaticcellculture
将体细胞在模拟体内生存环境的体外条件中进行培养，使细胞生长增殖，并保留其完整结构和功能特性的方法。
原代细胞培养primarycellculture将体细胞在模拟体内生存环境中进行培养，使细胞生长增殖达到可传代状态的培养方法，3.3
cellcryopreservation
细胞冷冻保存
将体外培养细胞与冻存液按一定比例混匀后，按设定的降温速率降温，使其于液氮中长期保存的过程。
4工作区条件
工作区一般要由准备室、缓冲间、无菌室、细胞保存室组成其中.缓冲间面积应不小于3m.并设有更衣柜和紫外灯，紫外灯的强度为不少于1.5W/m。紫外线灯管距地面不应超过2.5m，每次照射时间为20min～30min。无菌室无菌等级的最低标准应达到万级。
5主要仪器、设备
超净工作台、冰箱、鼓风干燥箱、高压蒸汽消毒器、液氮生物容器、离心机、电子天平、CO，培养箱、超纯水装置和显微镜等。
6清洗与消毒
6.1玻璃器血清洗与消毒
6.1.1浸泡
所需的玻璃器皿在含有洗涤剂的清水中浸泡12h。1
GB/T24863—2010
6.1.2刷洗
选软毛毛刷，反复洗刷后用清水冲洗3次，三蒸水冲洗3次后，60℃下烘干后备用6.1.3酸浸
酸浸时间为24h。
6.1.4冲洗
酸浸后先用自来水反复冲洗10次以上，最后用超纯水浸洗3次～5次，烘干包装。6.1.5消毒
高压灭菌应以0.14MPa～0.16MPa的压力下持续15min～30min。6.1.6初次玻璃器血使用
初次使用玻璃器Ⅲ需要先经过浸泡和洗刷再置于5%稀盐酸溶液中浸泡12h以上，其余操作同6.1.3、6.1.4和6.1.5等步骤。
6.2金属器血清洗与消毒
金属材质的器具除了没有酸浸处理步骤外，其余步骤同6.1。6.3塑料与橡胶制品清洗与消毒
塑料和橡胶材质的器具用清水浸泡和冲洗同玻璃器皿清洗，之后还需要用2%的NaOH溶液浸泡12h，清水冲洗和烘干后用1%稀盐酸浸泡30min，再用清水和三蒸水分别冲洗3次，高压灭菌和烘干后备用。高压灭菌以0.073MPa的压力下持续10min。7试剂与培养液
实验用水符合GB/T6682一级用水的要求。7.2平衡盐溶液
生理盐水或磷酸缓冲盐溶液（phosphatebufferedsaline，PBS)适用于细胞传代前漂洗细胞。7.2.1PBS
称取4.00gNaCI、0.10gKCI、1.45gNazHPO.·12H.O、0.10gKH.PO，加超纯水定容至500mL，调节pH至7.2.高压灭菌，密封后置于4C条件下贮存。7.2.2生理盐水此内容来自标准下载网
称取4.50gNaCl，加人500mL超纯水，高压灭菌，密封后置于4C条件下贮存。7.3血清
10%～15%的胎牛血清（fetalbovineserum，FBS)适合于家畜和家禽细胞的培养。7.4培养基
85%～90%的高糖最低限量必需培养基（minimumessentialmedium，MEM），适用于家禽细胞的培养；85%～90%的高糖Dulbecco改良Eagle培养基（dulbecco'smodifiedeaglemedium，DMEM），适用于家畜细胞的培养。用直径为0.22um和0.45um滤器过滤。7.4.1MEM(含Earle\s盐)培养基称取9.60gMEM.溶于1000mL超纯水中，加人2.20gNaHCO，使最终pH为7.2~7.4.用0.22um的滤器进行过滤、分装。从每瓶中取3mL～5mL用于检菌，其余置于4C条件下贮存。7.4.2高糖DMEM培养基
称取13.40gDMEM，溶于1000mL超纯水中，加人3.70gNaHCOs，使最终pH为7.2～7.4，用0.22μm的滤器进行过滤、分装。从每瓶中取3mL～5mL用于检菌，其余置于4C条件下贮存。7.4.3全培养基
培养基检菌3d后，取出未被污染的MEM或DMEM培养基加入特级FBS，使其终浓度为10%。用0.22μm的滤器过滤、分装。从每瓶中取3mL～5mL用于检菌，其余置于4℃条件下贮存。2
7.5消化液
GB/T24863—2010
称取0.10g（用于家禽）或0.25g(用于家畜）胰蛋白酶干粉，溶于PBS中，调pH至7.2~7.4，定容至100mL。无菌操作台内，0.22um滤器过滤除菌、分装，密封后一20℃条件下贮存7.6冻存液
MEM或DMEM的基础培养基加人终浓度为1O%二甲基亚矾（dimethylsulfoxide，DMSO）和20%～50%FBS.0.22μm滤膜过滤除菌，密封分装，置于一20C条件下贮存8体细胞体外培养与保存
8.1样品采集
8.1.1家畜样品采集
采集家畜耳缘组织、脏器。耳缘组织采集需先用75%的酒精对采样部位进行消毒，剪净耳毛后再进行消毒采样；采集脏器样品时要用生理盐水冲洗干净。根据实验需要选取大小适中的组织样品，放人5mL备有PBS或相应基础培养基的离心管中，封口后立即标记样品名称、性别、年龄、采样地点、采样部位、个体编号和采样时间等信息，并在记录本上记录。8.1.2家禽样品采集
采集家禽皮肤、适当日龄的胚胎组织，其余步骤同8.1.1。8.2样品运输
样品放人4C的采样箱后应迅速运往实验室。保存在PBS中的样品应在24h内进人原代培养阶段。保存在基础培养基中的样品应在48h内带回实验室进行原代培养。8.3原代细胞培养
8.3.1家畜细胞原代培养
在室温下的超净工作台中用PBS清洗家畜样品后，将组织样品剪成1mm大小的组织块，均匀涂于培养瓶底壁，倒置于37C、5%CO，和饱和湿度的培养箱中培养，待组织块微干并黏附在培养瓶底部后加人适量全培养基浸润组织样品，直至组织样品贴壁牢固时翻瓶加液进行原代培养。8.3.2家禽细胞原代培养
家禽的脏胎需要去掉脑、眼、四肢和内脏，其余步骤同8.3.1。8.4传代培养
8.4.1家畜细胞传代培养
当家畜细胞汇合达到培养瓶底壁的80%～85%时，弃去培养基，用生理盐水或PBS清洗3次，加人适量的0.25%的胰蛋白酶到培养瓶顶壁，37C、5%CO，培养箱中放置5min，翻瓶，再置于培养箱中作用30s，倒置显微镜下观察到细胞质回缩，细胞间隙增大时，拍打培养瓶使细胞分散。然后立即加入全培养基，分瓶培养
8.4.2家禽细胞传代培养
培养家禽细胞时，加人适量的0.10%胰蛋白酶，立即翻瓶，其余步骤同8.4.1。8.5细胞冷冻保存
传3代后，细胞汇合达到培养瓶底壁的80%～85%，按常规法消化细胞，加人全培养基，制成均匀的单细胞悬液，计算细胞总数。300g离心8min，弃上清，根据细胞总数加人适量冻存液混匀，使细胞密度达到1.0×10°个/mL~3.0X10°个/mL，按每管1mL分装于冻存管中，标明细胞名称、冻存管编号、性别和冻存日期。将冻存管放人程序降温盒中置于一70C条件下5h～6h或将冻存管放人程序降温仪5h～6h降温至一70C后，立即转人液氮中长期保存。
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