【商检行业标准(SN)】 饮用水中军团菌检测

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2528—2010
饮用水中军团菌检测
Determination of Legionella in drinkingwater2010-03-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
码防伤
2010-09-16实施
中华人民共和国出人境检验伦疫行业标准
饮用水中军团菌检测
SN/T2528—2010
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址www.spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印剧*
开本880×12301/16
2010年5月第一版
印张0.75字数16千字
2010年5月第一次印剧
印数1—1600
书号：155066·2-20860
本标准的附录A为规范性的附录，附录B为资料性的附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T2528—2010
本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国山西出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：李晓虹、李卫华、韩伟。本标准是首次发布的出入境检验检疫行业标准。I
1范围
饮用水中军团菌检测
本标准规定了饮用水中军团菌的检测方法。SN/T2528—2010
本标准适用于饮用水中军团菌的检测。工业用水和天然水及其沉淀物、沉积物和粘土/软泥等相关样本进行军团菌检测可参考此法。2规范性引用文件
丸是注日期的引用文件，其随后所有下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T27403
实验室质量控制规范食品分子生物学检测GB/T27405
实验室质量控制规范食品微生物检测SN/T1538.1
培养基制备指南第1部分-实验室培养基制备质量保证通则培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南SN/T1538.2
3定义和术语
下列术语和定义适用于本标准，3.1
军团苗
Legionella
本细菌为两端钝圆，具有瑞鞭毛，有动力，无芽孢和荚膜，需氧和兼性厌氧的大小为（0.3um0.4μm)×(2.0μm~3.0μm)或(0.5um
设备和材料
培养箱：36℃±1℃。
7umx（2.0um2pμm）的革兰氏阴性杆菌。L，分刻度0.1ml
4.2吸管：1mL、5mL和10
接种环：直径3mm。
天平：感量0.1g。
真空过滤系统。
灭菌平皿底直径9cm。
浊度仪。
PCR扩增仪。
台式离心机：最高离心力13000r/min。低倍双目显微镜。
恒温水浴锅：36℃士1℃。
黑色硝化纤维素过滤膜：直径47mm~50mm，孔径0.45μm。Milipore或同类产品。微量可调移液器。1μL～10μ，100μ,200μ，1000μ。旋涡振荡器。
电泳仪。
凝胶成像分析系统。
SN/T2528—2010
微波炉。
玻璃仪器。
培养基和试剂
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，试验用水和培养基配制应符合GB/T27405和GB/T27403的规定。
缓冲醇母浸膏琼脂培养基(BCYE)：见附录第A.1章。缓冲酵母浸膏琼脂培养基(BCYE-Cys)：见附录第A.2章。选择性培养基(GVPC培养基）：见附录第A.3章。血平板：见附录第A.4章。
酸缓冲液：见附录第A.5章。
Page\盐：见附录第A.6章。
2XTaq PCR Master Mix[o.1 U Taq Polymerase/μL,500 μmol/L dNTP each,20 mol/L TrisHCl(pH8.3)、1oomol/LKCl、3mol/LMgCl.]。5.8
PCR引物：见表1。
5SrRNA
引物名称
琼脂糖(电泳级)。
溴化乙锭。
DNAmarker。
军团酋引物序列及扩增片段长度引物序列(5\-3\)
ACTATAGCGATTTGGAACCA
GCGATGACCTACTTTCGCAT
ATGATAGCTTATGACTGGTA
TTCCTTTGTTCACTCAGTAT
TAE电泳储备液（50×）：见附录第A.7章。军团菌分型诊断试剂盒。
检验程序
军团菌检验程序见图1。
BCYE和BCYE-Cys/
板二次培养
军团菌的检测程序
扩增片段大小/bp
7检验步骤
7.1取样
7.1.1总则
SN/T2528—2010
根据给水系统和检验目的确定收集样品的体积。要详细记录样品的来源、体积、取样时的温度和是否含有灭菌剂及其性质，以助于实验室检测。基于安全和分析原因，不要检测未知来源的样品或是冷却水、过程水，除非这些样品有关于化学添加物的信息，或是在过程中可能存在的污染物的信息。7.1.2取样容器
用无菌玻璃、聚乙烯或类似容器收集水样品10mL～1000mL。样品容器的材料也应适用于饮用水。若离试样点较远，使用易碎的玻璃容器不安全的，可使用塑料制品。7.1.3含生物防腐剂的样品
如果水样含有或是认为含有氧化型灭菌剂时，在取样时或取样前应先使其钝化。注；对于氯和其他氧化型灭菌剂，可通过加硫代硫酸钾或硫代硫酸钠到容器中钝化。7.1.4样品运输和储存
实验室接到水样后应尽快进行微生物学分析，最好是取样当天，最多不超过2d。如果是在取样的当天分析，样品运输时在室温状态下，避免光照就可以了。否则，需在冷藏条件5℃土3℃下运输样品。热水样应在取样后直接冷却，
7.2膜过滤
过滤10mL～1000mL水样。按照以下步骤通过酸缓冲液处理样品，以抑制非军团菌的生长。样品过滤后，加人30mL酸缓冲液，静置5min。膜过滤去酸缓冲液，用20mLPage'盐或其他洗液洗涤膜。小心地用无菌锻子转移膜，正面向上放置在BCYE或GVPC琼脂平板上，确保没有气泡。7.3培养
倒置平板在36℃士1℃培养2d～10d。培养期间保持湿润的培养环境。7.4
检查平板
在10d的培养期间，经常观察。用显微镜在3d～4d内至少观察两次。记录可疑军团菌菌落的数量。军团菌的生长很可能被其他菌掩盖或抑制。如果怀疑被抑制，或是有强的生长背景，需重新稀释样品或减少过滤的样品体积。在黑色滤膜或黑色背景下，典型的军团菌菌落通常是白-灰-蓝-紫，但也可能出现棕色、粉色、灰绿色或深红色。军团菌表面光滑，边缘整齐，出现典型的毛玻璃现象。注：通过膜过滤的军团菌在培养基的生长更加缓慢，且通常菌落比直接在培养基上生长的要小。7.5可疑军团菌的确证
7.5.1BCYE-Cys的二次培养
在BCYE或GVPC平板上次日生长的菌落均不是军团菌。从BCYE或GVPC平板上选择2d后生长的至少5个可疑军团菌菌落接种到BCYE和BCYE-Cys两块平板上进行二次培养，如果可疑菌落的形状不同，确保每一形状至少挑取两个菌落，36℃土1℃培养至少2d。在BCYE平板上生长而在BCYE-Cys平板或血平板上不生长的被认为是军团菌。记录每个平板的结果。7.5.2血清学鉴定
从BCYE或GVPC平板上挑取可疑菌落纯化后，用多价诊断血清作玻片凝集实验。有条件的可作分型实验。
7.5.3PCR检测
7.5.3.1PCR模板的制备
挑取从BCYE或GVPC平板上可纯菌落混于100μL蒸馏水中，振荡混匀，100℃煮沸5min～10min，10000r/min离心5min，取上清液作为模板。7.5.3.2多重PCR反应体系和条件一反应体系体积为50μL：10μmol/L引物S1、S2各1μL，20μmol/L引物S3、S4各5μL；2×3
SN/T2528—2010
TagPCRMasterMix25μL;模板DNA3μL;ddH,O补足50μL;反应条件：95℃预变性5min；94℃变性1min，60退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸5min，4℃保存反应产物。7.5.3.3PCR质控对照
每次进行PCR检测时均需要设置阳性对照、阴性对照和空白对照。其中，用军团菌标准阳性菌株提取的DNA作阳性对照。用非军团菌的标准菌株提取的DNA作阴性对照。用灭菌双蒸水替代模板作空白对照。
7.5.3.4PCR扩增产物电泳检测
取1.5g琼脂糖于100mL电泳缓冲液中加热，充分融化，加人溴化乙锭，使其最终浓度达到1.0μg/mL，制胶。在电泳槽中加大电泳缓冲液-使液面刚刚没过胶面1mm。取10.0μLPCR扩增产物点样。9V/cm恒压，电泳20in～30min。紫外凝胶成像仪下观察电泳结果，做好记录。PCR扩增产物为104bp、996bp(见表1)。
8结果及报告
8.1当在BCYE或GVPC平板上次日生长者，报告未检出军团菌/过滤水的体积。8.2当在BCYE或GVPC平板上不坐长，或在BCYE/GVPC平板上生长而在BCYE-Cys/血平板上也生长时，报告未检出军团菌/过滤水的体积。8.3当在BCYE或GVPC平板上生长而在BCYE-Cys或血平板上不生长的，同时血清凝集实验阳性者，报告检出军团菌/过滤水的体积。8.4当在BCYE或GVPC平板上生长，同时-PGR-产物扩增出片段长度为104bp者，报告检出军团菌(非嗜肺军团菌)/过滤水的体积。8.5当在BCYE或GVPC平板上生长，同时PCR产物扩增出片段长度为104bp、996bp两条片断者，报告检出军团菌(嗜肺军团菌)/过滤水的体积。8.6定量计算。挑取的可疑菌落经鉴定后，计数方法如下丛BCYE或GVPC平板上计算出在30个～300个之间的可疑菌落数（若超出300个要稀择）；从可疑菌落中挑取5个进行确证，若有3个证实是军团菌，则3/5乘以BCYE或GPC平板上在30个一300个之间的可疑菌落数，即为单位体积的可能军团菌数(CFU/过滤水的体积)
废弃物处理和防止污染的措放
检测过程中防止交叉污染的措施参见附录B2A.1一般要求
附录A
(规范性附录）
培养基和试剂
SN/T2528-—2010
为保证培养基的质量，宜按照SN/T1538.1和SN/T1538.2对培养基进行质量控制。A.2缓冲酵母浸膏琼脂培养基（BCYE)A.2.1成分
酵母粉
活性炭
α-酮戊二酸钾
ACES缓冲液
（N-2-乙酰氨基-2-氨基乙磺酸）氢氧化钾
L-盐酸半胱氨酸
焦磷酸铁
蒸馏水
A.2.2制备
A.2.2.1半胱氨酸和铁盐溶液
120-g-
1000mL
制备新鲜的L-盐酸半胱氮酸私焦磷酸铁溶液：称取半脏氨酸和铁盐0.4g和0.25g分别加到10mL蒸馏水中。溶液通过孔径为o.22um的纤维素酯滤膜过滤灭菌。间不超过3个月。
A.2.2.2ACES缓冲液
N-2-乙酰氨基-2-氨基乙磺酸血到500mL蒸馏水中，45一20℃存贮于灭菌容器中，时
50水浴溶解。称取氢氧化钾于
480mL蒸馏水中，混匀至溶解。混专以上两种溶液即为ACES缓冲液。A.2.2.3培养基
活性酵母浸膏和α-酮戊二酸连续地加人到-980mL的LACES缓冲液中。0.1mol/L氢氧化钾(5.6g十1L蒸馏水），0.1mol/LH,SO,（5.3mL十1L蒸馏水）。用以上两种溶液调整培养基的pH至6.8士0.2。加入琼脂，121℃，15min高压灭菌。5℃避光保存于密闭容器内，不超过4个星期。A.3
缓冲酵母浸膏琼脂培养基(BCYE-Cys）配制见第A.2章，不加L-半胱氨酸。A.4选择性培养基(GVPC培养基）注：GVPC培养基是在BCYE培养基中添加了三种抗生素和甘氨酸。A.4.1成分
游离的氨基甘氨酸
硫酸多粘菌素B(多肽类抗生素）万古霉素
80000IU/L
SN/T2528—2010
放线菌酮
放线菌酮也可用那他霉素代替。A.4.2制备
A.4.2.1抗生素的制备
称取硫酸多粘菌素B200mg加人到100mL的蒸馏水中，使其终浓度为14545IU/mL。混合。通过孔径为0.22μm的纤维素酯滤膜过滤灭菌。吸取5.5mL于灭菌容器中，储存于一20℃。使用时室温溶解。称取适量的万古霉素20mg加入到20mL的蒸馏水中，混合。通过孔径为0.22μm的纤维素酯滤膜过滤灭菌。吸取5.5mL于灭菌容器中，储存于一20℃。使用时室温溶解。称取适量的放线菌酮2g加人到100mL的蒸馏水中，混合。通过孔径为0.22um的纤维素酯滤膜过滤灭菌。吸取4mL于灭菌容器中，储存于一20℃。使用时室温溶解。抗生素溶液冷冻保存最长时间为6个月。注：放线菌酮对肝脏有毒害，称量其粉末时要戴橡胶手套和防尘面罩，A.4.2.2GVPC培养基的配制
按照A.1配制BCYE培养基的步骤进行，在加过α-酮戊二酸后添加3.0g甘氨酸氨氮盐，调pH到6.8士0.2。添加L-半胱氮酸和铁以后，各添加A.4.2.1中三种抗生素5.5mL、5.5mL和4mL，混合。5血平板
A.5.1成分
豆粉琼脂（pH7.4~7.6）
脱纤维羊血(或免血)
A.5.2制备
5mL~10 mL
加热溶化琼脂，冷到50℃，以灭菌手续加入脱纤维羊血，摇匀，倾注平板。亦可用其他营养丰富的基础培养基配制血琼脂。
6酸缓冲液
A.6.1成分wwW.bzxz.Net
氯化钾
A.6.2制备
A.6.2.1溶液A：0.2mol/L盐酸
在1L蒸增水中添加17.4mL(p=1.18，35.4%）或是20mL（p=1.16，31.5%）浓盐酸。混合，121℃高压灭菌15min。
A.6.2.2溶液B:0.2mol/L氯化钾
在1L蒸馏水中溶解14.9g氯化钾，混合，在121℃高压灭菌15min。A.6.2.3制备酸缓冲液：混合3.9mL溶液A和25mL溶液B制备酸缓冲液，用1mol/L氢氧化钾调pH到2.2士0.2，用带塞的玻璃溶液保存。在黑暗状态下室温放置不超过1个月。A.7Page盐
A.7.1成分
氯化钠
七水硫酸镁
二水氯化钙
磷酸氢二钠
磷酸二氢钾
双蒸水
A.7.2制备
1000mL
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将上述化学试剂添加到蒸馏水中，溶解、混合，在121C高压灭菌15min。为精确称量以上化学试剂，先制备10L盐溶液，然后分装成小体积灭菌。TAE电泳储备液（×50）
冰乙酸
0.5mol/LEDTA溶液(pH8.0)
加蒸馏水
使用时稀释成1×电泳缓冲液。
定容至100mL
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B.1抽样和制样过程
附录B
（资料性附录）
检测过程中防止交叉污染的措施抽样和制样工具，应清洗干净，121℃高压灭菌15min～20min，一套洁净工具限于一份样品使用。存放样品的容器应该经过清洗、高压，或为一次性灭菌容器。B.2检测过程
B.2.1PCR实验室应分为样品制备区、前PCR区、PCR区和后PCR区。将模板提取、PCR反应液配制、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从“洁净”到“污染区”单向进行。
B.2.2实验过程中，应穿戴实验服和手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。B.2.3
各区所有的试剂、器材（尤其是移液器）、仪器都应专用，不得带出该区。B.2.4所有溶液、水、耗材和器具要121℃，15min高压，避免核酸和(或）核酸酶污染。每种溶液应使用高质量的成分和新蒸馏的双水。在20℃～25℃贮存的试剂中，可加人0.025%的叠氮钠。所有试剂应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。B.2.5
DNA模板或引物的离心管打开之前，要短暂离心，离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶。前PCR区中，最好能在PCR操作箱中加人PCR反应各组分。实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA。可使用UDG和dUTP系统控制污染。应遵循PCR操作的其他要求。
书号：155066·2-20860
SN/T2528-2010
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