【商检行业标准(SN)】 化妆品胚胎和发育毒性的小鼠胚胎干细胞试验

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2330—2009
化妆品胚胎和发育毒性的
小鼠胚胎干细胞试验
Cosmetics embryotoxicity and developmental toxicity ofmiceembryonicstemcelltest
2009-07-07发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2010-01-16实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
化妆品胚胎和发育毒性的
小鼠胚胎干细胞试验
SN/T2330—2009
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：68523946
68517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×1230
2009年11月第一版
字数32千字
2009年11月第一次印刷
印数1-2 000
书号：155066·2-19942
定价21.00元
本标准的附录A、附录B、附录C、附录D为资料性附录,附录E为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中山大学本标准主要起草人：程树军、项鹏、焦红、陈蕊、秦瑶、温巧玲、许崇辉、潘芳本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准SN/T2330—2009
1范围
化妆品胚胎和发育毒性的
小鼠胚胎干细胞试验
SN/T2330—2009
本标准规定了化妆品胚胎和发育毒性小鼠胚胎干细胞试验的试验原理、试验准备、试验方法、结果和报告。
本标准适用于化妆品原料/化学品潜在胚胎毒性的筛选和检测。本标准为胚胎和发育毒性的动物试验的替代方法之一，结合其他替代试验或动物试验用于化学物质毒性的整体评价。
本标准也可供制药、农业、工业化学物质、食品添加剂和其他污染物胚胎和发育毒性试验的参考。2术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。2.1
胚胎干细胞embryonicstemcells,Es来源于胚胎内细胞团或原始生殖细胞，能无限分裂并保持未分化状态，具有向胚胎三个胚层来源的所有细胞分化的能力。
胚胎体embryoidbodies，Ebs
在体外培养环境中，胚胎干细胞培养体系中撤除抑制细胞分化的因子，胚胎干细胞就会失去保持未分化状态的能力，可以自发形成多细胞结构，即胚胎体，胚胎体中含有内胚层、中胚层和外胚层3个胚层的细胞。
分化differentiation
分化是一个过程。在分化的过程中，细胞内一些特定的基因开始表达，而其他基因并不表达，从而一个非特化的细胞特化成为一个具有特殊结构并执行一定功能的细胞。2.4
成纤维细胞fibroblast
是蔬松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起，细胞的形态结构可随其功能状态的不同而改变。
embryotoxicity
胚胎毒性
外源性化学物直接或间接地作用于胚胎产生胚胎毒作用，表现为妊娠着床前早期或着床后阶段胚胎的自动丢失，如吸收、流产、死胎和整个胚胎或器官和系统生长发育迟缓等。2.6
小鼠白血病抑制因子miceleuckemiainhibitoryfactor，mLIF用于维持小鼠胚胎干细胞增殖和未分化的状态的一类生长因子2.7
悬滴培养hangingdropmethod
用于诱导胚胎干细胞分化为胚胎体样结构的一种细胞培养方法，以观察细胞生长和发育过程。1
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半数抑制浓度IDso
抑制ES细胞分化为心肌细胞50%的受试物浓度。2.9
胚胎干细胞半数致死浓度IC5oESES细胞生长和活力抑制50%的受试物浓度2.10
成纤维细胞半数致死浓度IC503T33T3成纤维细胞生长和活力抑制50%的受试物浓度。3试验原理
胚胎毒性试验或用妊娠动物在体内进行，或用培养的胚胎以及来自妊娠动物的胚胎组织或细胞在体外进行。这儿种体内和体外试验必须以牺性动物为代价。本试验基于胚胎毒性作用中最重要的指标，即受试物对胚胎和成体组织的毒性损伤存在敏感性差异，这种差异与分化的抑制程度密切相关，胚胎干细胞（ES)对毒性物质的反应比成体细胞更为敏感。本试验采用两个永生化的小鼠细胞系：mES为小鼠胚胎干细胞，代表胚胎组织；3T3为成纤维细胞，代表成体组织。mES细胞在白血病抑制因子（mLIF)存在的情况下能保持未分化状态，在适当条件下ES细胞具有形成胚胎体和分化成主要的胚胎组织的能力。通过评价抑制胚胎干细胞分化的能力和抑制ES、3T3细胞生长的能力，预测受试物的潜在胚胎毒性。
4试验材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸水或超纯水，试剂最好选用进口试剂4.1细胞www.bzxz.net
4.1.1胎鼠成纤维细胞（Balb/c3T3细胞）：来源于Balb/c小鼠，最好来源于美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。4.1.2小鼠ES细胞（mES）：推荐ESD3细胞系，来源于129小鼠，最好来源于ATCC(No.CRL1934）；如有充分证明，也可使用其他细胞系，如E14Tg2A（ATCCNo.CRL1821）。欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures,ECACC)。4.2细胞培养基制备
4.2.13T3常规培养基/检测培养基：10%胎牛血清（FCS）、4mmol/LL-谷氨酰胺、50U/mL青霉素、50uμg/mL链霉素。
4.2.23T3冻存培养基：20%FCS、4mmol/LL-谷氨酰胺、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素、10%DMSO。
4.2.3mES完全培养基：20%FCS、2mmol/LL-谷氨酰胺、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素、1%NAA，0.1mmol/Lβ-疏基乙醇、1000U/mLmLIF，4℃保存不超2周，用于ES细胞维持未分化状态。4.2.4mES检测培养基：20%FCS、2mmol/LL-谷氨酰胺、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素、1%NAA、0.1mmol/Lβ-疏基乙醇
4.2.5mES冻存培养基：40%FCS、2mmol/LL谷氨酰胺，50U/mL青霉素，50μg/mL链霉素、1%NAA，0.1mmol/L疏基乙醇、10%DMSO。4.3试验试剂
4.3.1H-DMEM：高糖DMEM.推荐Gibco公司或HyClone公司的产品。4.3.2L-谷氨酰胺。
4.3.3胎牛血清（FCS）：56℃加热灭活30min。2
4.3.4小牛血清：56℃加热灭活30min。4.3.5胰酶/EDTA（Trypsin/EDTA)：配成0.25%。4.3.6青霉素/链霉素双抗：青霉素（100U/mL），链霉素（100μg/mL）。4.3.7二甲基亚（DMSO)：用于非水溶性化学品溶剂，或用于冻存细胞。4.3.8非必须氨基酸（Nonessentialaminoacids.NAA）。SN/T2330—2009
4.3.9β-疏基乙醇（β-mercaptoethanol.β-ME)：工作液浓度为10mmol/L，可用PBS配制，4℃下可保存1周。
4.3.10小鼠白血病抑制因子（mLIF）：原液浓度为10°U/mL的mLIF，一20℃保存，融解后保存在4℃，可保持活性约1年：原液浓度为10°U/mL的mLIF，可用PBS（含1%BSA）或培养基按1：10稀释后保存在一20℃或4℃。
唑蓝.3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2.5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromide，MTT4.3.11
异丙醇（isopropanol或propan-2-ol）。4.3.12
十二烷基硫酸钠（SDS），又称月桂基硫酸钠（SLS）：用水配成20%储存液，室温保存。4.3.13
磷酸缓冲液（D-PBS)：无Ca2+和Mg2+，保存于室温或4℃冰箱中。4.3.155-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU)：阳性对照物，以D-PBS配制，按终浓度2mg/mL分装保存于-20℃。
青霉素G：阴性对照物，以终浓度1000U/mL分装保存于一20℃。4.3.174
牛血清白蛋白（BSA)：组织培养用。4.3.18
台盼蓝：配制成10mg/mL水溶液。9超纯水。
4.3.20无水乙醇。
4.4MTT溶液
4.4.1MTT贮存液：通常使用的浓度为5mg/mL，称取MTT0.5g，溶于100mL的磷酸缓冲液（PBS），用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包裹。需注意，MTT法只能用来检测细胞相对数量和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT吸光度最好在0～0.7范围内4.4.2MTT解吸液：3.49mL20%的SDS贮存液与96.51mL异丙醇混合·使用前新鲜配制.如出现沉淀温育至37℃。
4.5耗材
4.5.1培养瓶：25cm和75cm2用于常规培养。4.5.2培养血：60×15mm和100×20mm，用于细胞常规培养和悬滴培养。4.5.396孔平底组织培养微孔板
4.5.424孔组织培养板。
4.5.52mL细胞冻存管。
4.5.60.22μm微孔滤膜。
4.5.7不透光管（lighttighttubes）或铝薄纸遮蔽管（wraptubes）：用于光敏性物质溶液的配制。4.5.8封口膜：用于封闭96孔板，防止化学物质挥发，如Dynatech公司（CatNo.M30）。4.6仪器和设备
4.6.1培养箱：温度37℃±1℃，相对湿度90%±5%，5%±1%CO2。4.6.2层流洁净柜（生物安全标准）。4.6.3恒温水浴箱：温度37℃士1℃。4.6.4倒置相差显微镜
4.6.5电子天平（精确到0.001)。3
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4.6.696-孔板分光光度计（酶标仪）。4.6.7移液器：单通道或多通道移液器4.6.8微孔板摇床。
4.6.9细胞计数仪或血球计数器。4.6.10离心机（最好配有微孔板转子）。5试验过程
5.1受试物溶液的制备
5.1.1溶剂
参照附录A把受试物溶解在合适的溶剂中。所选择的溶剂其浓度不能具有细胞毒性和对细胞分化有任何影响，且该浓度在试验过程中应始终保持一致。各溶剂推荐的最高浓度DMSO为0.25%，乙醇为0.5%
5.1.2预试验受试物浓度范围的设置以受试物的最高溶解浓度和无细胞毒性的最高溶剂浓度作为最高试验浓度，推荐采用2倍系列稀释法制备受试物浓度
5.1.3正式试验受试物浓度范围的设置以10进制儿何浓度序列稀释法，在梯度为1.2～3之间，按5.1.2\预试验”中确定的剂量-反应关系范围，以较小的稀释倍数制备6个～8个试验浓度。如稀释因子2.15（=/10)将一个1og单位分成等距离的3个间隔。稀释因子1.78（=V10）将二个log单位分成等距离的4个间隔。稀释因子1.47（=V10)将一个log单位分成等距离的6个间隔。稀释因子1.21(=/10)将一个log单位分成等距离的12个间隔。以因子1.47作为例子。加人0.47体积的稀释液稀释1体积最高浓度的溶液，混合均匀，取一体积此溶液加入0.47体积的稀释液，依次同样操作6次，即可得到以1.47为稀释因子的十进制序列稀释液。正式试验应设1个浓度的阳性对照物质（见5.3.3）。5.1.4注意事项
受试物制备应注意以下几点：
任何化学物质的最大试验浓度是1000μg/mL；a)
b）不要使用mES完全培养基制备受试物贮存液，因为血清蛋白质、受试物或其他成分可能在反复冻融中出现沉淀；
提前制备贮存液，包括阳性对照物5-氟尿嘧、双抗、阴性对照物青霉素G等可以冻存于20℃；
强酸和强碱化学物质可能影响培养基的缓冲能力，因此受试物溶解后，应目测检查最高浓度d）
受试物培养基的pH值，如变紫或浅黄（pH>8或pH<6.5），表明培养基缓冲能力下降，存液应用0.1mol/L氢氧化钠或0.1mo1/L盐酸中和；受试物如对光线敏感，应避免长时间曝露于光线（如显微镜）下，应在更换培养基前在显微镜下e)
观察细胞。采用不透光管或铝薄包裹的遮蔽管配制溶液：f）对挥发性受试物，应在受试物处理完培养板后，立即用可透过CO，但不能透过挥发性受试物的封口膜覆盖后再盖上板盖；
g）对未知受试物进行细胞毒性试验（见5.3）前，应测定含最高受试物浓度的检测用培养基（方法：加20uLMTT液于200μL。含最高受试物浓度的检测用培养基中，37℃、5%CO孵育2h）在550nm～570nm处的绝对光密度（ODs50-5zg）值，以排除化学物可能与MTT发生的化学反应。测得的OD值应>0.05。如OD值小于此值，而且所代表的浓度恰好在预期的ICso范围内，那么在试验的第10d，加MTT前，应把培养板上除空白外的所有培养孔中的培养基换成不含受试物的检测用培养基。4
5.2mES细胞分化能力检测
5.2.1mES细胞悬液制备
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mES细胞的维持培养参见附录B。为防止mES细胞贴壁，用60mm培养血制备浓度约为3.75X10*个细胞/mL的mES细胞悬液。用台盼蓝染色法检查mES细胞的细胞活力，如活力90%则细胞用于试验。试验过程中应不断轻微晃动细胞以保持细胞处于悬浮状态，并尽可能缩短培养箱外停留时间。
5.2.2试验程序（参见附录C)
5.2.2.1第一步（第0天）：悬滴培养，mES细胞集落形成根据5.1的方法将受试物溶于适当溶剂（如mES检测培养基）中，制备不同浓度的受试物溶液（每个浓度用一个培养皿）。然后加入制备好的mES细胞悬液，浓度为3.75×10*个细胞/mL。用移液器吸取20L含一定测试化学物的细胞悬液（约750个细胞）于100×20mm组织培养血的盖子内，每个盖子加50滴～80滴，每个浓度的化学物用一个培养血盖，空白对照组（mES检测培养基）和溶剂对照组也一样。小心翻转盖子于正常位置，培养血中加5mLPBS。COz培养箱悬滴培养3d。5.2.2.2第二步（第3天）：细胞悬浮培养，胚胎体形成制备不同浓度的受试物溶液，每一个浓度的测试化学物、空白对照（mES检测培养基）、溶剂对照分别各自使用一个培养血。吸取5mL含适当浓度受试物的培养基或溶剂于“悬滴”培养皿盖中，将培养盖倾斜约45°以使胚胎体（EBs）滑落底部，用5mL移液器（避免损伤EBs）轻轻将所有细胞悬液转移至60mm培养血。注意悬滴”中的化学物浓度与培养皿中的保持一致。COz培养箱继续培养2d。5.2.2.3第三步（第5天）：24孔板培养，心肌细胞分化制备不同浓度的受试物溶液，每一浓度的测试化学物、空白对照和溶剂对照分别各自使用一个24孔板。往24孔板的各孔中加入1mL同一浓度的测试溶液。用吸头以约40μL体积每孔加1个EBs。注意确保含EBs的测试溶液的与培养板孔中的测试溶液浓度一致。CO培养箱培养5d。5.2.3结果观察
试验第10d时.相差显微镜下仔细观察每个培养板各孔含自主收缩心肌细胞的孔数，并记录。5.2.4质量控制
5.2.4.1—般要求
重复试验至少1次（2次有效试验），第2次试验时.应另外配制试剂5.2.4.2细胞质量控制
分化期末（第10d)检查溶剂对照板，如果24个EBs中至少21个已分化为自主收缩的心肌细胞，则试验结果可接受。比较空白对照板数据（mES检测培养基）和溶剂对照板的数据可确定溶剂对mES分化有无影响。如果使用了最高允许浓度的溶剂，则溶剂对照和空白mES检测培养基对照都要设置5.2.4.3检测过程的质量控制（阳性对照）一批新的冻存细胞解冻后和新的化学物测试前，应采用5氟尿嘧啶为阳性参照物进行检测过程的质量控制。以mES细胞测定ID的值。最终检测浓度是0.07、0.06、0.05、0.04、0.03pg/mL5-FU从2mg/mLPBS贮备液开始稀释。5-FUIDs的值应该在0.048μg/mL～0.06μg/mL的范围内5.2.4.4FCS的质量控制
每批FCS都要在无化学物质下进行分化能力测试，结果应是24孔中至少21孔出现心肌细胞，并重复2次·而且应是在细胞质量良好的情况下进行。完成血清测试后.5-FU作为阳性对照也应检测至少2次。
5.3mES和3T3细胞毒性检测试验过程5.3.1试验程序（参见附录D）
5.3.1.1第一步（第0天）
mES细胞和3T3细胞的常规培养参见附录B。mES细胞和3T3细胞的细胞毒性检测采用96孔SN/T2330—2009
板，其结构如图1。常规培养制备ES或3T3细胞悬液1×10+个细胞/mL，用多通道移液管加50uL培养液于96孔板周边各孔，为空白对照，余下各孔加50μL浓度为1×10+个细胞/mL的细胞悬液，每孔细胞浓度为500细胞/孔。可用台盼蓝染色检查细胞活性，活力>90%可进行试验。5%CO，37℃孵育2h，使细胞贴附。2h后，加150μL含一定浓度化学物质的检测培养液（试验液），注意150μL体积应含1.333×的终化学浓度。加150μL无化学物的检测培养液于周边空白对照孔.5%CO,37℃孵育3d。2
CO溶剂对照；
b空白(检测培养液)；
5678９10
C,～Cg——八个浓度的受试物（Ci：最高浓度.C：最低浓度）。C5
注：当进行质量控制时（见5.3.3.2)，Cl～C：则为不同浓度的阳性对照，空白对照为1000U/mL青霉素G图196细胞毒性试验溶液分布图
5.3.1.2第二步（第3天）
用多通道移液管吸出试验溶液（除周边空白对照孔），注意不要破环孔底的细胞层，加200L新制备的试验液（终浓度同第0天）。5%CO237℃继续培养2d。5.3.1.3第三步（第5天）
用通道移液管吸出试验溶液，加200μL新的试验溶液（每孔终浓度与0d相同），再培养5d。第10d检测细胞抑制情况。
5.3.2结果观察
5.3.2.1显微镜检查
相差显微镜下观察细胞，记录由于受试物的细胞毒性作用引起的形态变化，同时用来排除实验误差，镜检细胞毒性并不作为本试验的检测终点。5.3.2.2MTT测定
加20μLMTT（5mg/mL）于培养板上所有孔中，37℃孵育2h；2h后，小心倾倒或用吸管吸出MTT液，将板翻转置于吸水纸上1min；每孔准确加130μL温至37℃的MTT解吸液；在微孔板摇床上完全摇动微孔板15min以溶解蓝色偶氮，直到溶液清亮无碎片，如果孵育后集聚仍存在，在测定吸光度之前，可用多通道移液器上下反复吹打，使沉淀重悬；酶标仪测定溶液在550nm～570nm的吸光度。5.3.3质量控制
5.3.3.1细胞质量控制
试验第10天，MTT检测后，检查溶剂对照孔的绝对光密度（OD550-5）、（96孔板的2和11列），按照以往资料，应符合下列确认范围：mESES的OD550-570，95%置信限范围应在0.15～0.8之间或0.90~1.6之间；3T3细胞的ODs50-570，95%置信限范围应在0.15～0.6之间。6
5.3.3.2检测过程的质量控制（阳性对照）SN/T2330—2009
复苏新的一批冻存细胞和测试新的化学物质前，用5-氟尿嘧啶为阳性对照和青霉素G为阴性对照进行检查过程的质量控制。用于mES和3T3的最高测试浓度是1μg/mL5-FU（用PBS制备2mg/mL贮存液），按2倍稀释成序列，分别测定mES和3T3细胞5-FU的ICsc值。mES细胞和3T3细胞5-FU的IC5值的范围分别应该在0.048μg/mL~0.086μg/mL之间和是0.12μg/mL~0.5μg/mL之间。一个浓度的青霉素G（1000U/mL）置于培养板的同一列（3列），青霉素G浓度应该对细胞的活力无影响。每个细胞毒性检测除包括7个稀释度的测试化学物外，还包括1个固定稀释度的阳性对照化学物5-氟尿嘧啶。5-氟尿嘧啶的采用浓度来自mES和3T3细胞的IC5的历史平均值，对于3T3细胞和mES细胞分别是0.29μg/mL和0.06μg/mL。在这一浓度下，抑制率应该在20%～80%的范围内。6结果和报告
6.1ID50和IC5o的计算
分别计算mES细胞分化抑制50%的受试物浓度（ID）、mES细胞生长抑制50%的受试物浓度(IC5mES）和3T3细胞抑制50%的受试物浓度（IC53T3）。计算方法可选择概率作图法，x为log、y为概率单位，x轴是测试浓度的对数，y轴是影响作用的百分率。也可选择生物统计方法，模拟浓度-反应曲线更精确的计算出ID和ICs的值，并计算出这些值的置信区间。推荐用Litchfield&Wilcoxon图解法或Finney(1971)的概率单位分析法6.2毒性终点的计算
6.2.1mES细胞的分化检测
试验第10天，记录溶剂对照24孔培养板中出现收缩的心肌细胞的孔数，设此数为100%；记录每个给定受试物浓度的24孔培养板中含收缩心肌细胞的孔数：计算与溶剂对照培养板相比的分化抑制率（%）；采用电子记录表的形式记录数据。按6.1，计算ID0。6.2.2mES和3T3细胞毒性检测
测定空白孔平均OD550～570的值，并从96孔板所有孔的OD值中除去此值·用于校正培养板的塑料材料对于染料的粘附作用。测定溶剂对照孔的平均OD550～570值（列：2B-G和11B-G），将此值设为100%细胞活性。测定4到10列每列的平均OD值，每一列分别代表测试化学品的一个浓度，用细胞活性占溶剂对照孔的百分率表示。6.2.3数据记录
由酶标仪读出的光密度数据（OD570)直接转换成EXCEL表格（参见附录A），以标准格式保存的数据便于在不同实验室间进行统计比较和验证，而且平均OD值、标准差和活性百分率可以自动计算6.3毒性分类
6.3.1预测模型（predictionmodel,PM）如IC或ID的值超过1000ug/mL，则试验结果确定为1000ug/mL，表明进一步试验的最大浓度将是1000g/mL。而且在判别函数中将检测终点进行了变量转换，即IC5o3T3转变为Ig（ICs03T3），将ICsES转变为Ig（ICaES），将ID转变为（ICsa3T3-ID）/ICs3T3。6.3.2线性判别函数
用式（1)、式（2）、式（3)分别计算线性判别值I、Ⅱ、和Ⅲ：I=5.916lg(ICsa3T3)+3.500lg(ICsoES)—5.307（ICs3T3-ID)/IC53T3-15.27..=3.6511gIC5.3T3）+2.394lg(IC5.ES)2.033[(IC.3T3-ID..)/IC..3T3]-6.85...·..Ⅱ=—0.125lg(ICso3T3)-1.917lg(ICsES)+1.500[(ICs3T3—ID)/ICs3T3]-2.67...
.*...(2)
SN/T2330—2009
式中：
ICs.ES为ES细胞活力抑制50%的受试物浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；ICs.3T3—一为3T3成纤维细胞活力抑制50%的受试物浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；IDs为ES细胞分化为心肌细胞抑制50%的受试物浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）。由式（1)、式（2）、式（3)计算出的数值I、Ⅱ和Ⅲ用于6.3.3受试物的毒性分类。6.3.3毒性分类标准
如I>Ⅱ，且I>Ⅲ，判断受试物无胚胎毒性；如Ⅱ>I，且Ⅱ>，判断受试物弱胚胎毒性：如Ⅲ>I，且Ⅲ>Ⅱ，判断受试物强胚胎毒性。6.4试验报告
试验报告模式见附录E，应包括以下内容：a）受试物及制备：包括受试物名称、编号、贮存条件、理化特性、溶剂/赋形剂名称和使用、受试物溶解和中和方法等；
细胞及培养条件：包括细胞名称、供应商、传代数，培养条件，培养基名称、供应商和批号，血清b)
名称、等级、供应商、批号等；c)
试验方法：包括预试验过程和结果，试验可接受标准，试验过程描述等；试验结果：包括浓度样品的试验数据，计算数据等；结果解释。
附录A
（资料性附录）
受试物溶解液配制试验程序
100mg/mL受试物
解于PBS或DMEM?
100mg/ml受试物落
解于PBS或DMEM?
100mg/mL受试物溶
解于DMSO，培养基
1:400稀释后无沉淀？
15mg/mL受试物溶
解于DMSO,培养基
1:400稀释后无沉淀？
5mg/mL受试物溶
解干DMSO，培养基
1:400稀释后无沉淀？
以乙醇为溶剂，
操作程序同上
不相溶或使
用其他溶剂
300mg/mL受试物游
解于PBS或DMEM?
加入1体积的乙醇后溶
解，用培养基1:100
稀释后无沉淀？
200mg/ml.受试物溶
解于DMSO,培养基
1:400稀释后无沉淀？
在前两步之间找到最
大溶解浓度（稀释因
SN/T2330—2009
作为试验
贮备液
注：用于细胞毒性和分化检测的最高溶剂浓度是：乙醇0.5%，含50%乙醇的PBS1%，DMSO0.25%。图A.1
受试物溶解液配制试验程序
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