【商检行业标准(SN)】 化妆品急性毒性的角质细胞试验

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2328—2009
化妆品急性毒性的角质细胞试验Cosmetics acute toxicity of keratinocyte cytotoxicity test2009-07-07发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2010-01-16实施
本标准附录A、附录B和附录D是规范性附录.附录C是资料性附录本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T2328—2009
本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局本标准主要起草人：程树军、许崇辉、焦红、温巧玲、秦瑶、邱璐、郑秋月本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准I
1范围
化妆品急性毒性的角质细胞试验SN/T2328—2009
本标准规定了化妆品急性毒性的角质细胞试验方法的基本原理、试验准备、试验过程、结果和报告。本标准适用于化妆品原料和成品细胞毒性作用的筛选和检测本标准适用于预测啮齿类动物急性经口毒性试验的开始剂量，可作为毒性试验的一部分，结合其他试验用于受试物质毒性的整体评价本标准也可作为制药、农业和工业受试物质，食品添加剂和接触材料，以及其他污染物的毒性测定参考方法。
2术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。2.1
希尔函数
hillfunction
关于受试物浓度与反应关系的包含4个变量的S型对数数学模型。Y=Bottom+1+1elc.soc
Top-Bottom
Y是反应，X是剂量（或浓度）对数，Bottom是最小反应，Top是最大反应，logIC5o是反应剂量或浓度在最高（Top）和最低（Bottom）中间时的对数，HillSlope表示曲线的倾斜度。2.2
人角质细胞humankeratinocyte，HKC角质细胞是构成人体表皮的主体细胞，是一种可合成角蛋白的细胞，体内呈分层生长排列；体外分离的角质细胞来源于包皮或胸腹部等处皮肤组织。2.3
20%致死浓度IC20
在一定条件下使HKC细胞生长和活力抑制20%的受试物浓度。2.4
半数致死浓度IC50
在一定条件下使HKC细胞生长和活力抑制50%的受试物浓度。2.5
80%致死浓度IC80
在一定条件下使HKC细胞生长和活力抑制80%的受试物浓度3基本原理
本标准采用正常人角质细胞，应用中性红摄取（NRU）细胞毒性试验检测受试物的细胞毒性。体外培养的正常哺乳动物细胞不断地分裂增生，毒性物质不论其作用位点和机制如何，都会于扰细胞的分裂增殖过程，导致细胞生长速率下降和数量减少。培养中的正常细胞经受试物暴露后，细胞毒性表现为浓度依赖性的中性红摄取降低，据此可以得出有关细胞完整性受损和生长抑制等作用的信息。中性红（NR)是一种弱的阳离子染料，极易以非离子扩散方式穿透细胞膜并在细胞溶酶体内聚集。活细胞具有结合和连接中性红染料的特点。外源性物质作用引起的细胞膜表面的改变或溶酶体膜敏感性的改变，1
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引起溶酶体膜脆性增高及其他的变化，并逐渐不可逆。这些变化导致细胞吸收和连接NR的能力下降。这样就有可能区分活的、损伤的或死亡的细胞。角质细胞NRU细胞毒性检测程序是基于这一原理设计的一种反映细胞存活/活力变化的检测方法。4试验准备
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸水或超纯水，本标准列出了特殊试验材料的建议厂家，如有证据证明，可以使用替代品。4.1人角质细胞
人角质细胞可用原代或细胞系：a）人永生化角质细胞系HaCaT：商品化细胞系，可从美国标准生物品收藏中心（AmericanTypeCultureCollection，ATCC)获取；b）正常人角质细胞（NormalHumanKeratinocyte，NHK）：商品化细胞系，可从美国BioWhittaker公司（CloneticsCC-2507或CC-2607）获取；c）原代人角质细胞（PrimaryHumanKeratinocyte）：来源于儿童皮肤（包皮环切术）或成人皮肤，需符合有关伦理学规定。由实验室自行制备。4.2细胞培养基
4.2.1人角质细胞无血清基础培养基商品化购置或实验室自行配制，可从美国BioWhittaker公司KBM（KeratinocyteBasalMedium）或GIBCO公司K-SFM(KeratinocyteSerumFreeMedium）获取。4.2.2人角质细胞培养基补充试剂配制角质细胞完全培养基需补充以下活性成分：重组人表皮生长因子（EGF）、胰岛素（Insulin）、氢化可的松（Hydrocortisone）、庆大霉素、两性霉素和牛垂体提取物（BovinePituitaryExtract，BPE）。配制上述各种成分的贮备液浓度如下：0.1ng/mLhEGF0.5mL；5.0mg/mL胰岛素0.5mL；0.5mg/mL氢化可的松0.5mL：30mg/mL庆大霉系、15ug/mL两性霉系B0.5mL；7.5mg/mL牛垂体提取物2.0mL。上述补充试剂也可以由供应商提供试剂盒，如美国BioWhittaker公司（Clonetics，CC-4131）。4.2.3人角质细胞血清培养基
建议用无血清培养基培养角质细胞：a）角质细胞系（HaCaT)血清培养基：90mLMEM基础培养基，10mLFCS、1mL非必需氨基酸、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素：b）NHK和原代人角质细胞血清培养基：含15%小牛血清的黄素腺嘌呤二核苷酸培养液（DMEM:F12/3：1），含有腺嘌岭（24.3ug/mL），表皮生长因子（10ng/mL），转铁蛋白（5μg/mL），氢化可的松（0.4μg/mL），胰岛素（100U/mL），青霉素（100U/mL），链霉素(100μg/mL)。
4.2.4人角质细胞无血清完全培养基500mL人角质细胞无血清基础培养基（KBM或K-SFM），添加以下成分：0.0001ng/mL人重组EGF，5ug/mL胰岛素，0.5μg/mL氢化可的松，30ug/mL庆大霉素，15ng/mL两性霉素，30μg/mL牛垂体提取物。添加165uL氯化钙溶液，钙终浓度为0.10mmol/L。完全培养基保存在2℃～8℃，不超过2周。
4.2.5人角质细胞冻存培养基
MEM基础培养基，含20%FCS、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素、10%DMSO。4.3细胞培养试剂
4.3.1胎牛血清（FCS)：国产优质或进口，56℃加热灭活30min。4.3.2小牛血清：国产优质或进口。2
4.3.3裂解酶（DispaseⅡI）：用于原代人角质细胞分离培养SN/T2328—2009
4.3.40.25%胰酶/EDTA溶液；0.25%胰酶溶液与0.02mol/LEDTA溶液1：1混匀。4.3.5胰酶中和液（TrypsinNeutralizingSolution，TNS)。4.3.6青霉素/链霉素双抗（Penicillin/Streptomycin）：青霉素（100U/mL），链霉素（100μg/mL）。4.3.7二甲基亚（DMSO)：用于细胞冻存。4.3.8HEPES缓冲盐溶液（HEPESBufferedSalineSolution，HEPES-BSS）。阳性物质：十二烷基硫酸钠（SDS)，或称月桂基硫酸钠(SLS)。4.3.9
磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline，PBS）。Dulbecco's氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco'sPhosphateBufferedSaline，D-PBS）：含钙镁阳离子，葡萄糖随意，用于冲洗
中性红染料（NR）：组织培养基，液体或粉剂均可。乙醇：无水乙醇用于受试物制备，95%乙醇用于配制解析液。冰乙酸：分析纯
5无Ca2+或Mg2+Hanks平衡盐溶液（CMF-HBSS）。4.3.16
氯化钙贮备液：制备0.3M贮备液，高压灭菌备用。4.3.17
7超纯水。
4.4，中性红溶液
4.4.1中性红贮备液
首选商品化的液态NR贮存液，如SIGMA公司的组织培养基NR贮备液（N2889），浓度为3.3mg/mL。也可由干粉制备NR购备液：0.33gNR于粉溶于100mL纯水，赠备液应先置于暗处，室温放置2个月。
4.4.2中性红培养液
1.0mL中性红贮备液与预温至37℃的99.0mL完全培养液混合，中性红的终浓度为33μg/mL，使用当天配制。NR培养液应用0.2μm～0.45μm的滤膜进行过滤以减少中性红结晶，中性红培养液在加入细胞前应在37℃水浴中温育.在制备后30min内使用.或在离开37℃水浴后15min内使用4.4.3中性红解析液（乙醇/醋酸液）按体积比配制中性红解析液，含1%冰乙酸、50%乙醇和49%水。4.5受试物制备
见附录A。
4.6耗材
4.6.1组织培养瓶：25cm2和75cm2，用于常规培养。4.6.2培养皿：60mmX15mm，用于细胞常规培养。4.6.396孔平底组织培养微孔板。4.6.42mL细胞冻存管。
4.6.50.2μm微孔滤膜
4.6.6带盖无菌玻璃试管（5mL，10mL）。4.6.7pH试纸
4.6.8移液管和吸头。
4.6.9封板膜
4.7仪器和设备
4.7.1培养箱：温度37℃±1℃，湿度90%±5%.5%±1%CO2。3
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4.7.2层流洁净柜（生物安全标准)或生物安全柜。4.7.3恒温水浴箱：温度37℃土1℃。4.7.4倒置相差显微镜
4.7.5电子天平。
4.7.696-孔板分光光度计（酶标仪）：配540nm士10nm滤光片。4.7.7移液器：单通道或多通道移液器，用于吸取细胞、洗板溶液、NR培养基和解析液等操作，不可用于吸取受试物。
4.7.8微孔板摇床。Www.bzxZ.net
4.7.9细胞计数仪或血球计数器。离心机（最好配有微孔板转子）。4.7.10
4.7.11水浴超声波破碎仪。
磁力搅拌器。
旋涡混合器
4.7.14过滤器/过滤装置。
4.7.15抗静电离子发生器/消磁枪：用于中和96孔板静电5试验过程
5.1基本要求
除NR贮备液外的所有溶液、玻璃器皿、吸头等都应无菌，所有操作应在无菌条件和无菌环境下进行。角质细胞毒性试验流程见附录B。5.2试验前考虑因素
5.2.1对于在试验条件下具有挥发性的受试物，IC5的变化可能比较大，尤其当化合物的毒性非常低时，可以采用能透过CO2但不能透过挥发性受试物的塑料薄膜封闭培养盖加以解决。5.2.2难溶解于无血清培养基的物质可能不易测试，其体内毒性潜力可能被低估。5.2.3水中不稳定或发生爆炸的受试物不能用于试验。5.2.4特异性的攻击处于分裂中细胞的物质，其体内毒性可能被高估。5.2.5受试物对细胞内溶酶体具有选择性作用时，可能会出现细胞活性读数偏低的情况。如硫酸氯喹，它能改变溶酶体的pH值，产生抑制NRU的作用。5.2.6除非在经过冲洗后细胞内仍残留有足够量的该种受试物，并能溶解于中性红溶液中，否则红色的受试物在中性红所在的波长范围内产生吸收作用，可能干扰试验结果5.3角质细胞的培养
5.3.1角质细胞培养及冻存
参见附录C。
5.3.2角质细胞的无血清培养
用于毒性检测的角质细胞最好一直用无血清培养基培养，含血清培养的细胞用于检测前应改为无血清培养，注意培养基的转换应逐步进行，并记录细胞在转换培养基中形态的变化。无血清培养的角质细胞在组织培养瓶中常规生长成单层，在温度37℃土1℃、湿度90%土5%和CO2浓度5.0%土1%条件下培养，每天相差显微镜观察细胞，记录细胞形态学的改变或细胞粘附特性。5.4：角质细胞的制备
5.4.196孔细胞板的分布
本试验方法采用96孔板，其结构如图1。A
VCI和VC2
溶剂对照（无受试物，有细胞）；6
8个浓度的受试物（C1：最高浓度，Cg：最低浓度）；h
8个浓度的阳性对照（只加SLS，无细胞）（CI：最高浓度.C8：最低浓度）；VCb—溶剂空白对照（无受试物，无细胞）。图1阳性对照和受试物在96孔板的分布5.4.2角质细胞接种96孔板
达到对数生长期的细胞可接种于96孔板用于检测，操作如下：a
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当细胞培养瓶中的角质细胞超过50%融合（不到80%）时，去除培养液，用5mLHEPES-BSS冲洗两次，每次5min，去除清洗液；加2mL胰酶/EDTA液于培养瓶，15s~30s后吸出，室温孵育3min~7min，当超过50%的b)
细胞浮动时，轻轻拍打培养瓶使细胞脱壁：当绝大多数细胞脱壁时，加入5mL室温胰酶中和液（TNS)轻轻吹打细胞；c)
用5mLCMF-HBSS冲洗培养瓶，将细胞悬液转移至离心管；d)
220g左右·离心5min，去除上清液；以完全培养液轻轻吹打，重悬角质细胞沉淀形成单细胞悬液，计数细胞；以完全细胞培养液制备细胞悬液使细胞密度为1.6X104/mL～2.0×10*/mL。用多通道移液g）
器，加125L完全培养液于96孔板的外周孔（空白），余下孔加125L细胞悬液（2×103细胞/孔~2.5×103细胞/孔），一种受试物用一个培养板（见图1）；孵育细胞，保证细胞形成20%以上单层（约48h～72h），使细胞恢复、贴壁和进人指数生长期；h)
倒置相差显微镜下观察细胞，保证细胞在整个微孔板上生长相对一致，同时检验试验过程有无错误操作，记录观察结果。
5.5受试物染毒性
5.5.1准备2×溶液板
预先准备一个无菌的空板（96孔细胞板），在进行细胞测试之前，在这个空板加人200μL/孔稀释液。受试物、空白对照液的排列顺序和方式应与测试板相同。试验开始时，使用多通道微量移液器将2×溶液从空白板上转移到测试板的对应孔上，确保起始处理时间的一致，并使开始反应时间的误差减到最小，同时还会避免次序混乱。5.5.296孔板加样
在细胞孵育48h～72h后（也即在细胞达到20%融合后），直接加入125μL合适浓度的受试物溶S
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液、阳性对照溶液或者溶剂对照溶液到测试孔中。不要更换完全培养基。用同一刻度的多通道移液器将贮备液从2×溶液板（空白板）转移到测试板上。例如，可以首先转移空白组（1，2.11和12列），紧接着从最低浓度到最高浓度加入受试物，这样用同一套吸头就可以完成整个细胞板的加样。溶剂空白对照孔（VCb）（列1列12.孔A2，A11，H2，H11）加人溶剂对照赠备液。无细胞对照孔A3-A10和H3-H10应该加入某一种浓度的受试物（如：孔A3和孔H3加入浓度为C1的溶液）。孵育细胞48h士0.5h5.5.3阳性对照
对于每次检测的一组受试物，应设置独立的阳性对照板。如果需要对多个受试物进行多次检测，就要仔细为每一次检测设计好阳性对照，每一组测试都是一个单独的试验。实验负责人将决定有多少受试物需要使用阳性对照。而且从阳性对照（如SLS）得出的平均IC50士2.5标准差（去掉极端值）数值：将作为本试验方法敏感性的可接受标准。阳性对照板的排列方法和操作程序与受试物相同（包括浓度设置和结果标准，见5.4）。
5.6镜检评价
细胞孵育至少46h后，相差显微镜观察每个培养板，辨别是否存在细胞接种操作错误，观察对照组与试验组细胞的生长特性。记录由于受试物的毒性作用而发生的细胞形态学的变化，这些记录不能作为细胞毒性的定量指标。对照组细胞出现非预期的生长特性表明可能存在实验误差，并且可能成为实验失败的原因。采用表1描述细胞培养情形，确定细胞的量化得分，并做好记录。表1细胞培养观察代码
代码编号
正常细胞形态
低水平细胞毒性
中等水平细胞毒性
高水平细胞毒性
5.7中性红摄取测定
中性红摄取操作如下：
代码编号
存在沉淀物的正常细胞形态
存在沉淀物的低水平细胞毒性
存在沉淀物的中等水平细胞毒性存在沉淀物的高水平细胞毒性
由于沉淀物观察不到细胞
a）小心除去完全培养基（含有受试物），并用250μL预热的D-PBS小心冲洗细胞。倾倒冲洗液，用吸水纸吸干剩余冲洗液。加250μL含中性红培养基到所有孔中，孵育3h士0.1h。中性红培养基孵育期间（2h~3h内），观察细胞是否形成中性红结晶体，并做好观察记录。如果有过多的中性红结晶体形成，实验负责人有权决定这个实验无效；b)
孵育结束后，去除中性红培养基，用250uL预热的D-PBS小心冲洗细胞：倾倒并吸干D-PBS，准确加入100L中性红解析液到所有孔中，包括无细胞组；d）
在微量滴定板振荡器上快速振荡20min～45min，以便从细胞中提取出中性红，形成均一的溶液。在振荡期间，细胞板应用遮蔽物进行遮光处理：从振荡器上取下细胞板，静置至少5min。如果观察到有气泡，应确保在细胞板读数之前已经e
破裂。在540nm士10nm处测定吸收值，以空白组为对照；f）
对角质细胞来说，空白组的平均OD值为0.055±0.035（土2.5的标准差），可参考这个范围评价空白组的数据。保留试验的原始记录。5.8试验的质量控制
5.8.1可接受试验标准
试验需满足以下4个标准：
阳性对照的IC50值应在历史平均值的2.5倍标准差范围内，并满足标准2和3，且由希尔模型a)
计算出的r（决定系数）的值应大于等于0.85；6
b）空白对照平均值两侧的偏差不会超过所有空白对照组平均值的15%；SN/T2328—2009
在大于0%和小于50.0%的活性范围内，至少应出现一个可计算细胞毒性的值，同样在大于c）
50.0%和小于100%活性范围内，至少应出现一个可计算细胞毒性的值；d）如果一项实验，在0到100%之间只有一个点，并且使用的是最小的稀释因子1.21，同时其他实验标准都符合，这个实验也可接受。5.8.2检查细胞接种错误
为了检查实验是否存在系统性细胞接种错误，应将未处理的空白对照组放在96孔板左边第2列和右边第11列。在实验中，空白组细胞单层出现偏差可以反映出存在某种具有挥发性的毒性物质，如果怀疑具有挥发性，可以着手进行5.8的实验。细胞接种的检查也可以通过相差显微镜观察细胞形态进行。
5.8.3不溶性受试物补充规定
如果采用最严格的溶解程序仍不能得到实验验收标准所要求的毒性，那么在3次确定实验之后，实验负责人就可以终止这种特殊受试物的所有实验。对于空白对照组来说，经过修正的平均OD540nm土10nm的值只是作为试验应达到的目标范围，而不应作为一个实验的验收标准。5.9挥发性受试物
高挥发性的受试物在其孵育期间可能会从培养基中挥发出来形成蒸汽，这些蒸汽可能会被再吸收进人临近的孔中，这样离最高浓度剂量孔最近的培养孔由于暴露于可以再吸收的受试物蒸汽而被污染。如果在剂量测试实验中表明这种受试物质具有特殊的毒性，那么靠近最高剂量受试物的空白对照（VC1)则可能出现明显交叉污染，细胞活力显著降低。如果怀疑受试物具有潜在的挥发性（如低密度液体）或者如果未密封细胞板的试验结果表明空白对照组有毒性（即VC1和VC2细胞活力出现了>15%的差异），则应按照以下程序密封细胞测试板：a）根据附录A和5.3的程序制备细胞板和受试物重复试验；在用可疑挥发性受试物处理96孔细胞培养板后（见5.4.2），直接（用手或微孔板滚柱）将粘性b）
细胞板封闭剂覆盖到培养孔上。确信封闭剂黏附到每一个培养孔。把96孔细胞板盖子盖到已封闭的细胞板上，按5.4.2条件孵育细胞。注意板盖不要太紧以免封闭剂变形导致其从培养物孔上脱落：
c）孵育结束后，小心地去除细胞板的封闭剂以免溢出，然后按照5.5的步骤进行后续步骤。6结果与报告
6.1计算IC50
从浓度-反应关系计算ICso，并计算IC20和ICso等相关数据，以μg/mL或mmol/L表达，至少应保留三个有效数字。推荐采用以下两种方法进行统计分析，其他专业统计学方法也可应用a）图表法或对数-概率单位法计算ICso；b）用非线性的回归方程计算IC50，推荐采用希尔函数，该函数是单一的S型曲线，可以作为多数剂量-反应曲线的代表模型。希尔函数分析最好通过统计学软件（如：[email protected])进行，应用前应检验曲线的符合程度。6.2预测模型
本试验的目的之一是以细胞毒性预测啮齿类动物急性经口试验的开始剂量·按照式（1）预测急性经口毒性试验的LDso，注意细胞毒性ICso以mmol/L为单位表达，动物急性毒性LDso以mmol/kg为单位表达。
log(LDsommol/kg)=0.435Xlog(IC.ommol/L]+..625...............(1)6.3试验报告
试验报告模式见附录D,应包括以下内容：7
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受试物及制备：包括受试物名称、编号、贮存条件、理化特性、溶剂/赋形剂名称和使用、受试物溶解和中和方法等；
细胞及培养条件：包括细胞名称、供应商、传代数，培养条件，培养基名称、供应商和批号，血清名称、等级、供应商、批号等；c)
试验方法：包括预试验过程和结果、试验可接受标准、试验过程描述等；试验结果：包括浓度样品的试验数据，计算数据等A，1总则
附录A
（规范性附录）
受试物制备
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试验负责人应直接指导受试物溶解方案的制定。受试物溶解或稀释之前应与室温平衡。受试物应现用现配，配制溶液不应出现混浊或者沉淀。每一份溶液至少应多配1mL～2mL，以确保有足够量的溶液加人到96孔板中，并建议配制容量为1mL的最高浓度为2×的贮存液（如：低溶解性的受试物质），冰冻至一70℃以备将来分析之用。对于可能具有光不稳定的受试物，建议在红色光或黄色光下制备溶液，以防其降解。对于以DMSO或者乙醇溶解的受试物，进行细胞毒性检测时，溶剂对照组和全部8个浓度测试组中DMSO或者乙醇最终浓度应为0.5%（体积分数）。A.2制备贮备液
应根据溶解液配制程序确定的受试物的最大溶解浓度来制备每一种受试物的贮备液，因此得到的用于细胞试验的最高试验浓度是：一如果受试物可溶解在培养基中，则细胞试验的最高试验浓度应为该物质最高溶解度的0.5倍：一如果受试物是溶解在乙醇或DMSO中，细胞试验的最高试验浓度应为该物质最高溶解度的1/200；
如果受试物细胞毒性受到其溶解度的限制，需要采用更有效的溶解操作以增加贮备液的浓度如将贮备液置于CO2培养箱中孵育，如果必要的话，还可以搅拌或者振荡3h以使进其溶解。对于用培养基制备的贮备液，瓶盖应该松一点，允许CO2交换。A.3范围确定实验
A.3.1通过一个覆盖大范围的固定因子对贮备液进行稀释，制备8个浓度的受试物溶液。最初的稀释序列应是对数稀释（例如10倍稀释）如果范围确定实验并没有产生足够大的细胞毒性，应尝试更高的受试物剂量：如果范围确定实验发现细胞活性呈一条双相曲线，那么对于随后进行的主实验的剂量选择应该覆盖最具毒性的量效反应范围（如图A：1所示，最具毒性的范围是0.001μg/mL～0.1μg/mL).
A.3.210倍序列浓度稀释
0.0100.100
1.00010,000100.0001000.00010000.000ConeenrrationAna/mLi
图A.1双相曲线
从上述最高浓度开始，其他7个较低浓度以一个1og单位为基础进行连续的稀释。举例说明在受试物应用到角质细胞之前，受试物溶解液和稀释液的制备。如果在溶解性试验中确定DMSO为首选溶9
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剂（假定为200000μg/mL），将受试物溶解于DMSO中使其浓度达到200000μg/mL，此溶液作为贮备液，用log单位稀释法制备受试物溶液：a）标记8个管，在2～8号管中分别加人0.9mL溶剂（例如DMSO)；b)）
将200000μg/mL受试物溶液溶解于1号管中制备贮备液；从1号管中取出0.1mL200000uμg/mL的溶液加人到2号管，使其稀释10倍（20000μg/c）
d）从2号管中取出0.1mL20000μg/mL的溶液加人到3号管，使其再稀释10倍（2000μgmL);
在剩余的管中连续制备10倍稀释液；f）
由于每一个浓度都比测试时所用的浓度200倍，因此取一份已溶解的受试物溶液加入到99份培养基中，形成1：100的稀释（例如0.1mL以DMSO溶解的受试物溶液十9.9mL培养基），从而在加入角质细胞前得到8个2×的试验浓度，每一个2×浓度的受试物溶液含1%体积的溶剂。在加入受试物之前，含角质细胞的培养板孔中加人0.125mL的新鲜培养基，然后加0.125mL2×浓度的受试物溶液到相应孔中，在总体积为0.250mL的混合液中受试物将会被恰当地稀释（最高浓度孔是1000μg/mL），同时溶剂的终浓度为0.5%体积比；g）某种在DMSO或乙醇中制备的受试物质在转移到完全培养基中可能会发生沉淀。应当对2X剂量的溶液出现沉淀物的情况进行评估，并且记录结果。在范围确定实验中2X溶液是允许出现沉淀的，但最终确定实验不能出现沉淀。A.4测试化学溶液的pH值
含有受试物的培养基加入到96孔板之前或者之后，立刻测量含受试物最高浓度2×的培养基的pH值（即测试板的C1，见图1）。用pH试纸（pH0～14和精密试纸pH5～10），pH试纸应与溶液充分接触大约1min，检测并记录pH值。注意所有浓度稀释培养基颜色的变化。不要调节pH值，A，5主试验的受试物浓度
A.5.1受试物浓度的确定
在范围确定实验完成后，每一种受试物质应在不同的3d分别进行一次确切的量效反应实验。依据从范围确定实验中估算出来的量效反应曲线的斜度，主实验浓度组的稀释因子应该小一些。在覆盖ICso的浓度范围内（分别在预期IC5o值的两侧），合适地选取2个以上具有级联关系的点，但应避免过多的无毒性浓度或者是过多的100%毒性浓度。如果实验得出在IC50值的两侧不足一个毒性浓度，这样的实验应该重做，而且在有可能的情况下，使用更小的稀释因子。每一个实验应该至少有一个细胞毒性的值落在0%～50.0%的细胞活力范围内，至少有二个值落在50.0%～100%的范围内。确定受试物的哪一个浓度值最靠近IC50，以这个值作为中心浓度，以相同的间隔选择更高浓度和更低浓度的稀释液进行最终实验。
A.5.2主实验的最大测试剂量
A.5.2.1完全培养基溶解的受试物对于溶解在完全培养基中的受试物，主实验中应用到细胞的受试物最大浓度应为100mg/mL，或者是最大的可溶解量。称取一定量的受试物加人玻璃管，然后加人一定体积的完全培养基，使其浓度达到200000μg/mL（200mg/mL）。采用机械方法使溶液混合，如果受试物在培养基中完全溶解，应从2X的200mg/mL的浓度开始连续稀释建立另外7个浓度溶液。如果受试物在培养基中的溶解度达不到200mg/mL，尝试以小幅增量方式加入培养基，通过加热、超声波等方法溶解受试物。如果范围确定实验的结果需要，也可以采用更有效的溶解方法。最高溶解度的贮备液用于制备另外7个贮备液浓度。
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