【农业行业标准(NY)】 接触传染性脓疱皮炎诊断技术

ICS11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1244—2006
接触传染性脓疱皮炎诊断技术
Diagnostic techniques for contagious pustular dermatitis2006~12-06发布
2007-02-01实施
中华人民共和国农业部
NY/T1244—2006
接自虫传染性脓痴皮炎（Contagiousg[Pusnjlardernatitis，CPD))又称羊口疮(ORF），是巾痘病毒科的副痘病毒引起的绵羊和山羊的一种按触传染性、嗜上皮性疾病，以在口、磨、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水疱、脓疱和疣状痴皮为特征，该病在我国属于第三类动物疫病，临床上很难与羊痘、口蹄疫区别。本标准的附录A、附录上、附录C和附录D为规范性附录。本标淮出中华人民共和国农业部兽医局提出。本标准由全国动物防接标准化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部动物检疫所、西北农科技大学，本标准卡要起草人：冀振华，张彦明，山志娜，郑增忍，郭福生，党岩，李会荣，1范围
接触传染性脓疱皮炎诊断技术
NY/T1244—2006
本标准规定了接触传染性脓疱皮病毒分离试验、电镜检查试验、动物接种试验和琼脂凝胶免疫扩散试验的诊断方法。
本标准适用于接触传染性脓疱皮炎临床诊断和实验室鉴定。2病原分离
2.1器材
100ml.玻璃细胞培养瓶，CX培养箱，超疗工件台，离心机，倒置尽微镜。2.2溶液配制
2.2.1试剂
MFM,特牛血清，水解乳蛋白，谷氨酰胺，胰蛋白酶（为细胞培养级），青霉素，链霉素，氯化钠，碳酸氨钠，氯化钾，竹檬酸钠（1个结品水），磷酸一氢钠（2个结晶水）.葡萄糖，酚红，磷酸氰一钠（12个结晶水)，麟酸二氢钾，硫酸镁(7个结晶水),无水氯化钙2.2.2溶液
青链霉素（双抗)溶液，3%谷氨酰胺溶液，7.5%的碳酸氢钠溶液，生理敲水，胎羊皮肤细胞生长液，胎羊皮肤细胞维持液.FTanks母液（10倍浓缩双）.0.01mol/LPFS溶，0.25%胰蛋白酶溶液，牛罩丸纫跑牛长液，I-H溶液，楼牛睾丸细胞维持液。溶液配制方法按附录A执行。2.2.3原代胎羊皮肤细胞或羊、续牛睾丸细胞，制备按阴录B执行。2.3样品的准备
2.3.1样品的采集
2.3.1.采集病羊的门.唇、乳房等部位的狮皮，置于放有十燥剂（硅胶或其他于燥剂)的火菌烧杯中，冒冰盒内送检
2.3.1.2采集木破裂的丘疹、水疱液，置含有0.01mcl/LPBS缓冲液的灭菌试管中，管冰盒内送检。0.01mnol/LPBS缓冲额的体积不能超过丘疹、水疱液体积的2借。2.3.2样品的处理
2.3.2.1将痫皮剪碎，研摩，按1:5的比例（W/V)稀释于0.01mol/LPBS缓冲液中，加双抗（青霉索201U/mL链需素2000mg/mL），制成感液。4%漫满16h~20h，以3000/min离心30min，取上清被，过滤备用。
2.3.2.2丘疹、水疱液加双抗（宵霉素2000IU/mL、链需素2000mg/mL），离心胶上清液，稀释、过滤备用。
2.4病毒分离培养
2.4.1取2.3.2处理好的样品1mL，接种单层滑羊皮肤细胞或快牛睾丸细胞，37℃吸附1h.小间操动一次。
2.4.2吸附究后每瓶加人9ml.维持液，37℃、5%CO培养箱中培养。2.4.3每天观察纫驱病变效应(CIE),连续观察5d。如果接毒后1d~5d内出现细胞变匾肿胀,细胞间质增宽，折光性增强，细胞脱落等病变，立即收毒，用方法5进行鉴定。如果言传3代无（PE，则判1
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为病毒分离阴性。
3病毒的电镜检查
3.1器材
电镜，曾通平血，滤纸，毛细管，3.2试剂
B6.8的2%磷鸽酸溶液，见附录
3.3样品采集和处理
方法与2.3树同，或将2.4的CPE培养液反复冻融3次，3000r/mi离心30min，取上清液备用3.4试验程序
用毛细管吸少量3.3中的样品或2.4的CPE培养液，直接滴在有支持膜的网上，悬液在网正旱半球形。2min-3mi后，用--片干次滤纸从网边吸去液体。用另一毛细管吸一滴磷钨酸染液滴在网上染色1min，用滤纸吸去染被，立即进行电镜观察或置丁燥器内短期保存。3.5结果判定
电镜内发现有椭圆形的线团样病粒子或发现表面有绳索样构、以“8\字形相斤交织排列的病南粒子,用方法5进行鉴定，
4动物接种试验
4.1试验程序
取样品上清液（见方法2.3)或经细胞培养出现CPE的细胞培养液（见万法2.4)0.2rL，划痕按种健康3--5月龄羔羊唇黏膜，
4.2结果判定
荐按种后34叫现划线红肿5d--7d出现水疱或脓疱等典型的临床症状，用方法5逊行鉴定。帮无症状，则判为阴性。
5琼脂凝胶免疫扩散试验
5.1器材
宜径6cm普通平血，内径4mm打孔器，微量样器，37℃恒温箱，5.2试剂
标阳性抗原、标准阳性血清，1%的琼脂凝胶，配制方法见附录D。5.3样品采集和处理
方法与2.3相同,或经细胞培养出现 CPF的培养液(2.4)。5.4试验方法
5.4.1用pH7.2、0.01mol/LPBS缓汁腋配制1%的琼脂凝胶，琼脂融化后，待温度达到50C左右时，倾注于预先准备好的灭菌平m内，厚度4mm,待凝固后备用。5.4.2用内径4mm的打孔器在已凝固的琼脂凝胶平血上打花孔（排列如下图所示）。孔距为3mm,打孔后用针挑山切下的琼脂块，火焰封底。@②
5.4.3用微量加样器吸取抗原或血清滴于孔内：中间孔滴加标准阳性血清，周围的1.3.5孔滴加被检样品，2、4、6孔滴加标推性抗原，所有孔以加满不溢出为度，加样后静置10min.放人37℃凝盒中进2
行反应。
5.4.4分别在24h.48l.72h观察并记录续果。5.5结果判定
判定时将琼脂平血置于暗背累或侧强光照射下观察。NY/T 12442006
5.5.1标准阳性血清利标准阳性抗原之间出现一条清晰的自色沉淀线，则认为试验可以成立，如果无沉淀线或沉淀线不明显，则本试验不能成立，应重做。5.5.2被检样品与标准阳性血清之间出现明显清晰色沉淀线，该沉淀线与标准阳性抗原孔和阳性而消之间的沉淀线木端相融合，被检样品判为阳性：5.5.3被检样品孔与标准阳性而清之间无沉线，标准阳性抗原和附性血清之间的沉淀线直伸被检样品孔边，被检样品判为阴性
5.5.4被检伴品孔与标准阳性面消孔之间不形成完整的沉淀线，但标准阳性抗原孔与标准阳性血清之间的沉淀线在被检样品孔端向标准阳性血清孔侧弯曲，该被检样品判为弱阳性，应蛋复试验，若重复仍为弱阳性反应则判为阳性。
5.5.5在标准性血清与检测样品孔之间的沉淀线粗面混油，该沉淀线与标准附性抗原与标准阳性血清之闻的沉涎线交义并直仲扰原孔达时则认为非特异性反应，应重复试验，若重复仍为交叉，被检样品判为阴性。
5.5.6凡在试验后24h、48h.72h出现沉流线时，应如实记录，并判定结果：凡在72h仍米出现沉淀线时则被检样品判为阴性。
6综合判定
6.1按5对样品上清激（见2.3)或经细胞培养出现CPE的细胞培养液（见2.4)检测为阳性时，则判定动物感染接削传染性脏疱皮炎病毒。6.2用3或4判为阴性的样品，经5试验确认为阳性结果，则判定动物感染接触传染性脓疮皮炎病痒。6.3用5判为阴性的样品，则判定动物末感染接触传染性脓疱皮炎病毒，NY/T 1244—2006
A.1胎羊皮肤细胞生长液
犊牛前清
L-H(0.5%水解乳蛋白-TIank没）双抗溶液
3%谷氨酰胺
附录A
【规范性附录】
病毒分离试剂
35mL（按常规方法配制）
用7.5%的碳酸氢钠调pH至7.0--7.2。置4℃保存。A.2青链零素（双抗)溶液
青密素
链舞素
1000 000 1U
1 000 000 mg
双蒸水
将双蒸水放于500imL瓶小高压103.4kPa20rin，青链霉索用少量双蒸水溶解后，再用双蒸水定容至100L
A.33%容氧酰胺溶液
谷氨酰胺
双蒸水
过滤除菌，分装于青素瓶中冻结保存。A.47.5%的碳酸氢钠溶液
磁酸氢钠(NaHCr）
双蒸水
100 ml
先将滤器灭菌后，加液你过滤后分装于青需瓶[放4℃保存备用。A.50.25%胰蛋白酶溶液
氯化钠(NaC)
氯化钾(KCI)
柠酸钠(2个结晶水)
磷酸二氢钠（个结晶水)(NaHPO1·HO)葡萄糖
胰蛋血醇
0.5%份红
加双蒸水
[OHI rnL
上还试剂依次游于量筒。胰酶用少量水调化后加人一部分水置37℃温箱中水溶溶解「h（时间4
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视溶化程度定，需透彻清亮）溶解的胰酶倒人量简中，用7.5%的碳酸氢钠调pH至7.6一7.8，定容至1000nl,后过滤除菌，分装小瓶，并作菌检，置-20℃冰箱保存。A.6胎羊皮肤细胞维持液
矮牛血清
双抗溶液
3%谷氨酰胺
置4℃保存备用。
生理盐水
氯化钠(NaCI)
双蒸水
20 rmL
1000ml
氯化钠化后分裂，103.4kPa15min高压，室温保存。A.8樊牛辈丸细胞生长液
双抗溶液
3%容氨酰胺
牛血清
20 rrL
临前用7.5%的碳酸氢钠溶液调pT为7.0～7.2,4C保存备用。A.9Hanks母液（10倍浓缩液）
氯化钠(NaCl)
12水磷氢二钠（12个结晶水）（Nn2HPO4-12H2())氣化钾(KC)
磷酸二氢钾（KHPO)）
7水硫酸镁（7个结晶水)（MgSO47HaO）葡萄糖
无水氯化钙(CaCl)
双蒸水
1000mL
在配制时，应先将无水氮化钙用-·小烧杯加人药100 nI.双蒸水，置4℃冰箱中落解。等其他药品潜解后，人混勾，定容至1000mLA.10L-H(0.5%水解乳蛋白-Hanks液）水解乳蛋白
Hamks母液（10倍浓缩液）bzxz.net
0.5%酚红
双蒸水
68.9kPa高压10min，置4℃冰箱中保存5
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A.11犊牛睾丸细胞维持液
双抗溶液
3脂谷氨酰胺
瘘牛血清
临用前用7.5%的碳酸氢钠溶液调plI为7.0~7.2.4℃保存备用。A.120.01 mol/, PBS溶液
0.2ml/L IB
氯化钠（NaiCI）
双蒸水
加至1000L
A. 12. 1pi7.2、0.2 mol/L PR溶液甲
溶液乙
混合后，置室温保存备用。
A.12.2 溶液甲
磷酸氢钠（12个结晶水)（Na2HI()4·12H2O)双蒸水
A.12.3溶液乙
磷二氢钠(2个结晶水）（NaH,P)-2HO)双蒸水
1 000 mL
1 000 mL.
B.1胎羊皮肤细胞的培养
附录B
(资料性附录）
细胞培养
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B.1.1尤菌取健康胎羊腹部或后肢内上侧皮肤小块，放人灭菌乎Ⅲ中，用眼科剪刀剪成0.5tmm3~1mm的小块，
B.1.2用含双抗(青缝索100IUJ/mL,链莓素100mg/ml.)的灭菌生理盐水（见附录A)冲洗数次，直至无血液，用Hanks液（见附录A)冲洗3次，倒掉Hanks液后移人灭菌三角烧瓶内。B.1.3灿人皮肤组织4倍体积的0.25%胰蛋白酶洗2次，第3次加入胰蛋白酶片放人37℃慎温水浴箱消化30min。
B.1.4用吸管吸出胰酶，册人Hanks液反复吹打，使成细胞悬液，用4层纱布过滤B.1.5滤液2000r/min离心10min，取细胞沉淀用生长液（见附录A）悬浮，分装于100mL细胞瓶(4×10°～6×10细胞/ml.),子37℃、5%，O2培养箱中培养。B.2续牛睾丸细胞的培养
B.2.1无菌采取1~3H龄健康黑白花续牛率丸，直接放入灭菌平血中，用含双抗（青莓素100IU/mL、链霉素100mg/mL）的灭菌牛理盐水冲洗4次，直至无血液B.2.2取出睾丸，放入平Ⅲ内，用眼科剪刀利镊子去掉自膜，将实质置于一灭菌烧杯中，加人双抗溶液（寺霉素10000[U/ml、链霉素10000mg/ml.）冲洗一次。B.2.3倒山液体，将实质剪痒，用Hanks薇冲洗4次，加人实质4倍体积的0.25%的胰蛋凸酶溶液冲洗2次，第3次加人胰酶后放人37℃恒温水浴箱中消化20min。B.2.4用吸管吸出映酶，加人Hanks液少许，用吸管反复吹打，细胞分散悬浮，B.2.5用4尽纱布过滤，滤液以2000r/min离心15min，去上清，用生长液悬浮细胞，分装于细跑瓶(4×103--6×105细胞/ml)，于37℃、5%00,培养箱中培养.
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C.12%磷钨酸
磷钨酸
附录C
(规范性附录）
电镜检查试剂
蒸馏水
定容至100ml
用1n1ol/L的氢氧化钠调pH为6.8,滤过后盖紧瓶盖，4C储存。8
D.11%琼脂凝胶
0.01mol/LPBS溶液
附录D
规范性附录)
琼脂凝胶免疫扩散试剂
混勾加热融化，待温度达50°左右时，倒平板。凝固后倒置于4℃储存。NY/T1244-2006
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