【农业行业标准(NY)】 禽网状内皮增生病诊断技术

ICS 11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1247-2006
禽网状内皮增生病诊断技术
Diagnostic technique for avian reticuloendotheliosis2006-12-06 发布
2007-02-01实施
中华人民共和国农业部发布
NY/T 1247-2006
禽网状内皮增牛病病毒（RcticulcenrlorheliosisViruses，REV）是一群不同于离白病病毒（AvianLcukosisVinuss.ALV)的反转录病毒，它包括-群血清学上密切相关的从不同种离类分离键的病毒，代表毒株有：从患有肿痛的火鸡分离到的T株、鸭坏死性肌炎病毒（SNV）鸡合胞侄病毒（CSV）、鸭传染性贫血病毒（DLAV)。以后义不断从不同的家禽和野离分离到该类病毒，就不再单独命名，只给予病毒名：
REV厚（-型反转录病每，有囊膜，旱球形，直径80m--110tm。其病南粒厂中的基因组是山“条相同的单股RNA.以非共价键连接在一起组成的，每条链长约8kb~9kb核节酸，REV被列为鸡群中除马立克氏病病毒(MDV)和ALV外的第三类效肿瘤病毒。由于REV可感染不同禽类，分别起从亚临床感染到生长迟缓、免疫抑制和肿瘤等不同的临床和病理变化，很容易与其他起类似症状和病理变化的疾病相混淆，在现场对该病的鉴别诊断就比较困难。人们注意到REV常常污染活疫苗（如马立克氏病和禽痘的活疫苗），但对其白然感染造成的经济损失还一声估计不足：本标准的编制参考了世界动物卫牛纠织（OIE）的《诊断试验和疫苗标准手册》（2000版）有关章节，本标准的附录A、附录B、附录C和附录D为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准向全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标起草单位：山东农业大学，本标准主变起草人：鲨治中.孙红。I
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1范围
禽网状内皮增生病诊断技术
本标准规定广禽网状内皮增生病诊断的技术要求。它包括两方而：对网状内皮增生病病毒(RFV)特异血清抗体的检测：病料及生物制品中传染性REV的检测。本标准适用丁：
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检测RFV的特异性抗体，用以判断禽群体（场）或个怀足否感染过RFV；特别适用于SPF鸡场中否存在REV感染的大批样品的抽检：检测疑似病禽的病料或某些弱毒疫苗中是否存在传染性REV2疾病的流行病学和致病作用
禽网状内皮培牛病的病原REV可感染鸡、火鸡、鹑、鸭和鹅等多种家禽及一此归牛鸟类。该病毒既可水平感染，也而通过鸡（离)胚垂直感染：当种离在并产后才感染1EV时，会有一短暂的病毒血症期，此期间可造成垂声感染。此外，部分个体在感染后可望现耐受性病毒血症，即持续性的病毒血症，这些个体血清中可能产抗休，但也可能不产生抗体。这些鸡（含)不定表现临床症状，但它们更是鸡（禽）群休中造成垂直感染的土要来源，飛直感染的离或在出壳后不久感染REV的个体（由丁应用了污染REV的疫出),最容易产牛耐受性病毒血症。RFV感染鸡群后，虽然可分别引起生长迟缓、免疫抑制或肿瘤发生，诱发完全不同的临床表现和病理变化，供在过去儿十年巾，并没有造成严重的流行。只是在REV污染的活病声安凿大面积使用时，才会造成严重的经济损失。
当REV感染雏鸡群后，可在一部分鸡引起无特殊临床表现的生长迟缓和免疫抑制。剖检时可见法囊和胸腺不同程度的萎缩，并导致对某些疫苗（如新城疫疫）免疫反应的最著下降。IIV引起的肿瘤既可见于6月龄以工的成年鸡，起叫见于2月·3月龄鸡。既可引发网状缅胞或其他非淋巴细胞类细胞的肿瘤，也可诱发淋巴细胞肿瘤（T淋巴细胞肿癌或乃淋巴细胞肿瘤）。因此，除非做病原学鉴定，仅根据流行病学，临床表现和病理变化是很难与鸡的马立克氏病或凹血病肿瘤相鉴别的，也根难与其他免疫抑制性病牵(如鸡传染性贫病毒)感染相区别。近两年来，在我国所做的血消流行病学调查和现场病例实验室诊断结果分析表明，在60%以上的鸡群（场)已有RFV感染。在病理上诊断为马立克氏病肿瘤或」-业型户血病肿瘤的现场样品中，在分离到立克氏病病高（MEV)或-业型H血病病毒（ALVJ)的时，也有近50%的样品同时分离到RFV，在表现为生长迟缓及免疫抑制的青年鸡雌中，也带常证明存在着REV与鸡传染性贫血病毒的其感染。显然，在鸡群感染EV时，其发病作用往往足在与其他病毒共感染过程中，以相互协同作用的形式表现H来的。正因为RFV感染时还经常发牛其他病毒的多感染，使现场病例的鉴别诊断变得更为复杂。州此，对REV感染的实验室诊断显得更为重要。3病毒的分离培养和鉴定
3.1病料的来集
疑似病鸡的血清或血浆，来集后经处理立即用于接种鸡胚成纤维细胞（CEF)培养或置于一70亡保存备用。疑似病鸡的脾脏、肝脏、肾脏，采集后立即研磨成悬浮液供接种CEF，或之即置于一70L保存。疑似污染REV的活病毒疫苗，在用于分离病毒前必须保存在相应疫苗规定的条件下。1

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3.2分离病毒用细胞
可选用需新鲜制备的原代或次代CEF单层，也可用悬浮培养的细跑系MSB细胞，3.2.1CEF细胞单层
按中国农业出版社2001年版中华人民共和国兽用生物制品质量标雅》附录“细胞制备方法”介的方法进行(见附录A)。
从SIF鸡胚制备的原代或次代CEF悬液，接种于细胞培养瓶皿)中形成细胞单层。为便于连续检测病毒，可在培养血中人数片盖瑕片。3.2.2MSB 细胞
为马立克氏病肿瘤细胞系，可连续悬浮培养，所用培养液为加5%10%胎牛血清的1DMEM培养液见附录B)
3.3待检样品的处理与接种
3.3.1血清或血浆
置」小离心管,在 10 /rin转速下离心 5 ri 后，取上消经0,45 pm谜器过滤后,取0.1 mT,-0.2 mL按种于面积约 30 cm 的含有EF单层培养瓶(血)中,或约含 3 ml.MSB,细随悬液的培养瓶(血)中。将细胞置于含5%氧化碳的37℃恒溢箱中继续培养，3.3.2脏器标本
将不同脏器充分研磨后，逐渐加人少量灭菌生理盐水继续研磨直率成句浆，然后按脏器童量的1倍～2倍加入生理盐水。将悬液移至小离心管中充分震播所，在10000r/min下离心5min，将上清用0.45pm器过滤，按3.3.1方法和接利的量接种CEF单层或MSI细跑悬。将细胞置于含5%一氧化凝的37恒温籍中继续塔养。
3.3.3疫苗样品
3.3.3.1马立克氏病细胞结合疫苗从液氮中取出后，在含疫苗的细胞悬液中加入9倍·～10倍量的灭菌注射用水,将细跑悬液移人小试管混匀,在4℃下放置10min,让细胞在低渗下毅解死亡。按3.3.1方法和接种量接种」含IEF单层的培养瓶（面)中：在37℃孵育2h后，吸太细胞培养液，换人新饼的细胞培养液：将胞罩于5%二氧化碳的37℃恒温箱中继续谱差：3.3.3.2其他病毒冻干活疫苗
将冻下活疫苗用无菊注射用水按每羽份加,人0,2mL进行稀释。取 0,2mL疫苗悬液与(1.2 mL抗相成度凿毒株的单因子血清（必须来自REV的SPF)混合，在4℃下作用60 min后,接种于面积约30cm的L长战IEF单层的细胞培养瓶（血)中。在37:下孵化2h后，倾细胞培养液，换入新鲜的含3%单闲子鸡血涛的细胞培养凝继缕培养。如稍关疫苗病毒在细胞培养工不易产牛细胞病变，则不须加血清进行中利。
3.4接种后细胞培养的维持
接种后,将细胞培养瓶(血)置」37:培养稍中培养2 l然后吸去培养液，换人新鲜培养液，以后每2大3大更换一次培养液：从第4大起，可每隔一大取出一片盖坡片供间接免疫荧光抗体反应(IFA)检测病毒用。REV感染 CEF后通常不产牛细胞病变,也不影响 CEF的生长复制。如果细胞率度过大，细胞单层有脱落的可能，可将细胞单层再次用0.25%胰酶溶液消化成纫跑悬液后离心，悬浮于新鲜培养液巾,将1/2-1/3的纫胞再接种于另新的已置人坡片的空自细范培养瓶(血)巾,继续增养。由于REV复制较慢，当原始病料病毒滴度很低时，接种病料的CEF至少维持培养和观察10天。
3.4.2MSI,细胞悬液
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接种样品后，每关观察细胞的密度，细施密度控制在5×105个L左石。当细胞缔度明显升高时，去掉·半细胞尽液，加人一平新鲜细胞培养液。一般每天观察和处理一次。从第4人开始，每隔一天取一滴细胞悬液于载玻片上，任其白然干燥，备作FA检测。3.5用特异性抗体作间接免疫荧光抗体反应（IA)鉴定病毒3.5.1细胞的固定
将盖玻片上的CEF或滴在载玻片上的MSB1细胞，在自然十燥后滴加丙酮：乙醇(6:4)混合液固定Smin，待其白然干燥后，这即用于IFA，或置于-20℃保存备用。3.5.2REV特异性抗体
作为第抗体，可用REV单克隆抗体，REV单因子鸡血清。3.5.3FIIC标记抗体
如第一抗体为REV特异性单克隆抗体，则选用市的FTTC标记的抗小鼠IgG山羊血清作为第二抗体。如第1抗体为抗REV单因子鸡血清，则选用市售的FIIC标记的抗鸡gY兔或山羊血清为第二抗体。
3.5.4间接荧光抗体试验(IFA)操作过程在固定有CFF细胞的善皱片或MSB的载玻片上，分别滴加一滴第抗休，即用pH7.4的PRS作T作浓度的单克隆抗体，或抗REV单因子鸡血清，在含100%相对湿度的37培养箱中作用40min，然后用PBS洗漆3次，再孤入丁作浓度的第二抗体，即用FBS稀释FITC标记的抗小鼠IgG或鸡TgY的免或山羊血清，在37℃继续作用40ri1，用PBS洗涤3次，在样品上少量50%口油水后将盖玻片上的样品倒扣」裁玻片上，或在载被片的样品上，册盖一张盖破片。在荧光最微镜下用10m波长的紫外线观察：同H，设衣感染的CEF或MSB，细胞作为阴性对照，及对检测样品设SPF血清做阴性对照。3.5.5结果的判定
被感染梭状的CEF细胞内呈现黄绿色光，周围术被感染的细胞不被着色或颜色很淡。在放大200×400×时，可见被感染细胞胞浆卷色，纲池核不易着色。因此，在一部分感染细胞中，可见荧北荐色的细胞浆使细胞呈校状，而其中的细胞核很暗，不着色。被RFV感染的MSB，显示黄绿色的荧光，缅胞质若色，而细胞核不着色，于MS细胞的细胞核较大，有的阳性细跑显示出黄绿色的荧光，围尚末被感染的细胞可显出细胞轮廓，在隔H逆续取样过程中，阳性细胞的比例明显增加，一般情况下，两种细胞在接种阳性病料5天～7天后，呈现荧光染色阳性的细跑比例放在70%以上。4血清特异性抗体的检测
检测鸡（禽）群（场）的REV抗体是否阳性或阳性率程度可用十以下儿个流行病学酬究的日的：①该鸡群（场）是古已有IEV感染，SPF鸡群必须定期检测共中是否出现抗体阳性的群休；②根据种鸡开产前后对REV抗体阴性率的变化趋势，判断种鸡产生垂直感染的可能性大小；雏鸡出光后，捡测母源抗休存在与否及阳性率，可判断其对水平感染的易感性，4.1样品的采集
可采集不同年龄鸡个血置」1.5mL的包端号的eppendo离心管中，在室温下放置20min，待血液白然凝固后，在台式离心机中以10000r/mim离心5min。吸l消，置于另一已编号的离心管小，」一20℃泳箱中冻存备用。
4.2抗体的检测方法
取决于实验室设备条件，既可采用EIISA也可选用IFA4.2.1 ELISA
可选用进口的试剂盒，严格按！家提供的说明书摄作。可适于大批量样品检测。4.2.2IFA
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IFA可用来比较个体抗体水平，检谢时需用白制抗原，在炭光品微镜下人工判读，不适于人批量样品，供成本较低：
4.2.2.1抗原
为固定在盖玻片或载玻片上(适用」少量伴品)或始孔细胞培养板上(适用人量样品，特别是确定抗体滴度时)的REV感染的CEF或MSB细胞(制备方法见附录D)：若同时用两种细跑比较，更能提高判断的准确性。盖玻片适立于高放大倍数观察细跑(如400×）,在96孔培养板上的IFA结果只能在100×200×下观察，
4.2.2.2操作过程
在租成的盖玻片上或抗原孔中加入用 1BS作不同滴度稀释的血清,在37C下作用 40 min,用 PRS洗涤兰次，亚加入用PBS作1:100 稀释(或按厂家说明)的 FITC标的抗鸡 IgY兔而血清(第二抗体),在37℃作用40min,用PR洗涤3次，加t少叠50%甘油水后在荧光显微镜下观察。4.2.2.3结果的判定
间3.5.5，
h
附录A
【规范性附录
鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备
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选择9口龄－10H龄发育良好的SF鸡杯，先用碘酒棉心用酒精棉消毒蛋壳气部位，无菌取出鸡胚，去头、四肢和内脏，放入灭菌的玻璃器血内，用汉克氏液洗涤胚体。用灭茵的剪刀剪成来粒大的小织块，门用汉克氏液洗2次--3次，然后剂0.25%胰嗨溶液（每个鸡胚约加4ml），在37.5℃-38.5℃水浴中消化20min~30imi1。吸出胰酶溶液消化产生的感液，再加入适单的营养液（用含5%10%线牛而清的汉克氏液，灿透宣的抗生素适量)吹打，用4层一6层纱布滤过。取少量过滤后的细胞悬液做细胞计数，其余在2000r/min下离心5min。将细胞沉凝再混悬十细胞培养液中，制成每毫升含活细胞数约100万~150万的细胞悬液，分装于培养瓶（血）中，避行培养：形成单层后签用（一般在24h内应用)。
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附录B
(规范性附录)
MISB,细胞培养基配制
商品化的DMEM液，加5%胎牛血清，pH7.6，青、链幕素：各250DIU/mL。培养条件：37℃，5%C02。
http://foodmate.net附录℃
（规范性附录)
抗REV单因子鸡血清的制备
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选择经鉴定仟共他落在病奇的REV参考株作为种毒，按种CEF后复制和扩增病毒。CEF在接种病毒后，继续增养，每隔1天2天换一次培养液.在第三次换波后48h收取上清波（通常可达到最离病毒效价）分装在小试管中，每支1mL，于70C冰箱保存，2天～3天后，取出一支，用细胞培养液作10倍系列稀释后，分别接种了含有新鲜配的CEF单层（细胞覆盖面应70%）96孔培养板上，每个稀释度8孔。在37℃下培养6天片，弃.上消液，用PBS洗次后，加入丙翻-乙醇（6:4)固定。待燥后，用抗REV的单克隆抗体，以IFA的结果来判定病毒感染的终点，测定其中REV的TCIDsn量。选用3周龄以上SPF鸡.隔离器饲养。每只鸡皮下接种104个TCIDs的REV悬液。3周后采集血。1FA抗休滴度应≥1:200。
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附录D
【规范性附录”
IFA法抗体检测用REV感染细胞的制备REV-CEF在10CIm?CEF单层细胞瓶（Ⅲ)中加人1.03TCIDn的RFV感液，隔一天换液。换液2天后将细胞单层用胰酶(见附录A)溶液消化分散成悬液，经离心后，重新悬浮于新鲜细胞培养液中，将细胞浓度谢至每毫升5×1.05个细胞，在加人盖玻片的培养血（直轻10cm）中如入10mL细胞悬液，或在96孔培养板上每孔加人100 血细胞悬液。在37C继续培养 3人。将盖玻片从培养,而中取出,在 PBS中漂洗后,滴加内-乙醇(6:4)固定液国定5min。弃去96 孔板中培养液,用1B5洗次后,滴咖丙酮-乙(6:4)店定液固定5mil，十燥后，用塑料薄膜包裹后置20℃保存：REV-MSB在含有10mlMSB细孢悬被(105个/mL)的细胞培养瓶(血)中,接种10°TCIDREV忌液。每天观察细胞感液中细胞密度，当细胞密度增大时，加人等量新鲜培养液，混勾后分至两块培养瓶（血）中，继续培养。在接种病毒后5天--6天，取少量细胞悬液按3.5方法做IFA，规察IFA阳性细胞比率，当阳性细胞达到50%时，即可收炭细胞，将细脑悬液滴加于96孔板中，每孔100μL。将96孔板在相成离心机上离心使细胞沉底贴壁，弃去上清液、加人50L丙酮：乙醇（6:4)混合液固定细胞，或将细胞悬液滴加丁盖般片上或载玻片上，任其自然下媒，再加丙酮：乙醇酉定液固定5min。下燥后用薄膜包裹后于20℃保存。
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