【农业行业标准(NY)】 牛羊胚胎质量检测技术规程

ICS65.020.30
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 16742008
牛羊胚胎质量检测技术规程
Detection procedures for quality evaluationiu embryos of bovine and ovine2008-08-28 发布
2008-10-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准的附录A为规范性附录，附录B和附累C为资料性附录。本标准山中华人民共利国农业部畜牧业司提出。本标雅由全密牧业标准化技术委员会与！..本标游起草单位：全国畜牧总站。NY/T1674—2008
本标准主要起草人：玉志刚、刘Ⅱ生朱天林、赵俊金、孙秀柱、于福清、张桂香、孙飞舟1范围
牛羊胚胎质量检测技术规程
本标准规定了牛羊胚胎形态评定利发育情况检测技术见程。本标滩适用于新鲜的，冷的体内肝胎和体外胚胎的质量检测。2规范性引用文件
NY/T 1674:2008
下列义件中的条款通过标的引用而成为本标准的条款。凡是注月期的引用文件，其随后所有的修政单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用丁本标准，然而.鼓礼本标准达成协议的各方研究是件可使用这些文件的最新版本。儿是不注H期的引用文件，其最新版本适用于本标准：GB/T5458液氮生物容器
GB/T18088山入境动物检疫采样
3术语
下列术语和定义适川宁不标准。3.1
超低温保存cryopreservation
在一196℃的超低温度中，胚阶新陈代谢停山从而使其长期保存。3.2
胚胎解冻cmbryothawing
将冷冻保存的胚胎按一定的程序融化，并脱除冷冻保护剂，使胚胎恢复新陈代谢的过程。胚胎体外培养
cmbryo in vira culture
胚胎在体外培养滋中模拟体内环境增养，低其继续发育的过程4抽样方法和保存
4.1抽样方法
抽样方法和数量参照GB/T18088。4.2样品的保存
样品应保在在一19%℃的液氮环境并符合如下条件：存放冷冻胚胎的低温容器应符合（GB/T5458规定：使用前经过清洗后加入液氮：取放样品时，在空气中暴露吋问不能超过55。样品由专人保管，不能脱离液氮，4.3信息的记录
抽样时，应详细记录样品包装上标记的信息。5检测环境
应在洁净环境条件下进行检测.
NY/1:16742008
检测方法
牛羊压胎质量检测操作方法见附录A，结果表述
××胚胎的发育阶段为×××,缀别为××;在3839、%二氧化碳、95%空气和相对饱和湿度条件下培券2. h(或48h),怀胎由义×阶段发育到x×阶段，2
A.1试剂
附录县
【规范性附录】
牛羊胚胎质量检测操作方法
A. 1. 1胚胎培养液（推荐使用 TCM199+20%FCS)A.1.2甘油
A.1.3乙二醇(FG)
A.1.4蔗糖
A.1.5 PBS 配方
PBS 配方见表 A. 1。
表A.1PIS配方
试剂名称
MgCl ·6H,O
A.1.5.1配制好的A,B液分别高压求菌.保待所。NY/T 1674—2008
8. 0 g/ 1.
0. 20 g/1
o.20 g/ 1
2. 16 g/L
0.20 g/1.
A.1.5.2使用前，把B液缓慢倒人A液，充分混合，每1溶液中添加内酮酸钠0.036g.葡糖1.0g牛m消白蛋4.0g（或灭活血消10mL-20rml.)和搅生数青霉素100U/m链每素100u/mL），充分混合片定容，用0.22μm滤器过滤除菌，待用：配成的PTs液plI为7.2~~7.3.渗透压290msm~300 m0sm。
A.1.6成品PBS配制
A.1.6.1用灭菌双蒸水分灿将A、B虑粉溶解，用容量瓶定容到1000rL。A.1.6.2加入灾流血清10mL20ml,充分混勾待用。A.1.7保存液：个0.4添卡血清户蛋白的PBS液。A.2仪器设备
二氧化碳培养bzxz.net
A.2.2胚胎冷冻仪
A.2.3液氨罐
A.2.4体视显微镜
A.2.5恒温台
电子天平（精确到口.1mg)
超净工作台
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A.2.8超声波清洗器
A.2.9超纯水器
A.2.10电热鼓风干燥箱
4.2.11高压灭菌器
A.3检测内容与方法
A.3.1待检胚胎应有完整的系谱资料（适用于体内胚胎和活体采体外受精胚胎）A.3.2样品包装的标记应规范完整A.3.3胚胎质量
A.3.3.1检测方法
A.3.3.1.1胚胎的形态学检测
借期十显微镜对胚胎的发有阶段和发育状况进行形态学观察。A.3.3.1.2胚胎的体外发育能力检测在38%~-39℃,%一氧化碳、5%空气和相对饱和湿度的条件下,对胚胎进行休外培养并丁24 h或481观察胚胎的存活情况和发育阶段。A.3.3.1.3冷漆胚胎成按照程序要求进行解冻后检测，肝胎解冻程序参见附录13A.3.3.2胚胎质量检测内容
A.3.3.2.1胚胎发育阶段
肝胎的发育阶段应与标注的阶段致：植人前胚胎各个阶段主要特点如下：a）案棋胚(morula)一—可观察到球状的细胞闭，细胞闭占透明带内腔50%～60%。b）致密桑肝(compacted morula,CM)一一卵裂球细胞进-步分裂变小，细胞团占透明内膀60%~7%
c）早期胚(early hlastocyst.EB)一一内细胞团的一部分出现露胚腔，但难以分清内细胞团和滋养层，细胞团占透明带内腔70%-~80%。获胚(blastocyst,BL）内细胞团利滋养岸界限清晰，胚腔明显，细胞充满透帮内腔。e）扩张胚(expancled blastocyst,FXB)—囊睦体积增大到原来的 l.2倍~1.5倍，透明带变薄。
）孵化愛胚(hatehed biastocysr.lB)一一胚腔继续扩天，明破裂，细胞团脱出。A.3.3.2.2胚胎发育状况
正常发育胚胎透明带究整，形态规则，色调均匀一致，透明度适中。根瑕形态学皮发育程度划分，脏胎质分为A,B、C,D四个等级，参考图片参死随录C。A.3.3.2.2.1A级
胚治的发育阶段与顽期的发育阶段一致。胚胎形态完整，轮廓清晰·星球形,分裂球大小均匀，结构紧矮，色调和透期度适，胚胎细胞断旱均匀对移的球形，透明光滑完憋，厚度适中，不规则的细跑杆对较少,变性细胞不高下%。
A.3.3.2.2.2B级
胚胎的发育阶段与预期的发育阶段基木一致。肝胎形态较完整，轮廓消晰，色调及细胸密度良好，透明带光滑光整，厚度适中，存在一定数量大小和形状不规则的细胞或细胞团.有-定数量细胞的颜色明暗不一，密度不均勾.犯变性细胞不高50%A. 3. 3. 2. 2. 3 C级
胚胎的发育阶段与预期的发育阶段不一致。胚胎形态不完整，轮廓不清晰，色调发培，结构较松散，游离的卵胞较多，但变性细胞不高于75%。A.3.3.2.2.4D级
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胚胎的发育阶段与预期的发育阶段不一做，包括退化的监胎、未受精卵或1细胞胚胎及16细胞以下的受精聊，内纫胞因有较多碎片、轮廓不清晰、结构松散，变性细胞比例高于75%。A.3.3.3相关要求
A.3.3.3.1每次至少2人参加检测，独立评定，得山综合评定结果。如果二者差异较大，刃外安排2人重新进行评定。
A.3.3.3.2鉴定结果成做鉴定记录，资料存档待查。5
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B.1甘油冷冻胚胎的解冻程序
B.1.1配制解冻液
【资料性附录”
冷冻胚胎解冻方法
分别配制含 10%,6%,3%日油的0.mo1/L蔗籍PBS解冻液，月0.221m滤器过滤除菌,K.1.2胚胎解冻
从液氮中取出装有胚胎的细管，室温下空气浴10 s后投人32℃ -~35C水浴中2 min。B. 1. 3脱除甘油
川消毒卫牛纸擦下细管前去封口端，将胚胎推人培养血中；然后，将胚胎侬次移人6%、3%.0%凸洲的0.1mol/L.熊糖TBS解冻液中，分别停留5tni；最后.用保存液洗3次，镜检。B.2乙二醇冷冻胚胎的解冻程序
B.2.1胚胎解冻
胚胎解冻操作步骤同 B. 1. 2。B.2.2脱除乙二醇
用消毒卫生纸擦干细管，剪发封口端，将胚胎推人培养血，用保存液洗3次，镜检6
桑湛胚胚胎质量示例
杯胎质节：A
胎质盘：B
2囊胚胚胎质量示例
环验威成：
1不胎质监：4
附录C
（资料性附录）
胚胎图片示例
E哈质量：A
旺胎底量：c
怀脏压度:注
游胎质量：B
原验质量：A
胎世：C
哈质境：A
的质量：B
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胚脏质员：4
脱胎质量：C
添脸适量：
际胎质登：C
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级胚胎质量示例
未受精卵
C.3.22细胞～16细胞
mw：：：...sm
变异胚胎
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