【农业行业标准(NY)】 绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程

ICS65.020.30
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1672—2008
绵羊多胎主效基因FecB
分子检测技术规程
Technical specification of molecular detectionfor prolificacy major gene Fec* in shecp2008-08-28 发布
2008-10-01实施
中华人民共和国农业部发布
NY/T16722008
Booroola(Fce5)基因是在绵羊中认别出的第一个高繁殖力卡效基因。Fcr基因的遗传效应是增加排卵数和产羔数。Bouroola绵羊骨形态发生蛋白受体B基因高度保宁心胞内激酶信号区域发生A746G突变，导效所编码的240氨基酸由谷氢放（Q)变成了精氨酸（R）。研究表明，核突变与Bo0-moola母羊的高繁殖力密切相关：通过检测绵羊是否势带高繁殖力主效基因Fcc，可以圳速我国绵羊多胎品系的选育步伐。特制定本标确。本标准由中华人民其和国农业部畜牧业司提山。本标准出全国畜收业标准化技术委员会归口。本标准起节单位：中国农业科学院北京畜牧曾医研究所木标准起草人：储明星、叶素成、力丽、刘忠慧、彭志兰、张跟喜、贾立华、孙洁、冯涛.1范围
绵羊多胎主效基因Fec分子检测技术规程小标准规定了绵羊多胎主效基因Fcc的分子检测为法。本标准适用于绵羊多胎主效能因F心的分子检测。2规范性引用文件
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下列文件中的条款通过本标准的引用而成为冰标准的条款。儿是注凡期的引用文件，其随后所有的悠改单（不包括勘误的内容)或修订版均不活用计本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各为研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注H期的引用文件，其最新版本适用于本标准GB/T6682分析试验室用水规格和试验方法GB/T19915.9猪链球菌2型溶血l素基因PCR检测方法SN/T1193基因捡验实验室技术要求3术语、定义和缩略语
下列术语、定义和缩略语适用本标准！多胎proliticacy
指－次分娩产山两个或两个以上胎儿：Fece
Fec?是在布鲁拉美利效(BooroalaMerino)绵羊中发见的能增加排卵数和产羔数的一.个常染色体突变基因、在缩羊中识别出的第一个高繁殖力主效基因，该主效基因已被绵羊和小羊遗传命名委员会定名为Feer（即Fec=fecundity，B一Booroola）。高繁殖力Fec禁四被定位到绵单6号染色体上对应于人染色体4q22~.23的区间：骨形态发生蛋白受体IB(bnne marphogeneticprotein rcceptorT3,BMPR-B)基因位于该区间：BoOrOola绵羊BMPR-IB基因高度保守的胞内激酶信号区域发生了A/46G突变，导致所编码的249位氮基酸由谷氨酰胺(Q)变成了精氨酸(R）。研究表明，该突变与Boorovla母平的高繁殖力密切相关。Fe即BMPRIE基因的746G或2i9R,Fcr+即BMTPR-IB基因的746A或249Q。两个Fe拷贝的携带者用FceBFeeP表示，简记为BB，一个Fcn\拷贝的携带者用FccFc衣示，简记为B十，非携带者用Fcc+Fec表示，简记为++。一个Fec\拷贝增加排卵数1.3枚～1.6枚，两个FecF拷贝增加2.7枚~~3.0枚，携帮一个Fe拷贝的母羊产蒸数增册0.9只~1.2只，捞呼两个Fce接贝的母羊产羔数增奶1.1只～1.7只，3.3
主效基因major gene免费标准下载网bzxz
上效基因是指对某一数量性状（或阈性状)的表型值产亚较大效应的单个基因或基固座。限制性内切酶restrictioneidonuclease限制性内切酶是-类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列.并由此划剂LNA双链的核酸内切NY/T1672—2008
限制性片段长度多态性restriction fragment length polymurphism(RFLP)限制性片段长度多态能是根据基函纽上限制性内切嗨的酶明位点核甘酸发生突变，或酶切位点之间发生核出酸的插人，快失而导微酶划片段长度发生变化：对案因突变进检测的种方法，3.6
单链构象多态性single strand conformaliunpolymorplisn（sscP)单链构象彩态性足根据学欲1NA片段在非变性聚丙烯酰胺谢胶电泳中所生现的不同带型来检测基因突变的一科方法。LNA片段中的一个核凸酸发生改变叫能会影响其单链的空间构象：间构象有差异的单链A分了在聚内龄酰胺凝胶中呈现不同的带型，据此可分辨不间的因型。3.7
缩略语
3.7.1 PcR：polymerase chain rcactio,聚合酶链式反3.7.2DNA：dcoxyribumuleit: eluid，脱氧接嫌核酸3.7.3dNTP：teoxyribonucleoid:triphosphate，脱氧核升=磷酸3.7.4bp：baseair，臧基对
3.7.5Q：glutaine，谷氨欣胺
3.7.6R：rginine，精氨酸
4原理
高繁殖力FecB基因定位于绵羊6号染色体上对应J人染色体4q2223的区问，该区间包含13MPR-TB基因。缔羊BMPR-I基函商度保T的胞内激嗨信号区域发生A74GG突变，可导致所编码的249位氨基酸由谷氨酰胺（Q）变成精氨酸（R）。研究表明，该突变与绵羊离繁殖力密切剂关。基这个点突变设计物对该区域进行PCR扩增以及RFLP或SSP分析.根据在凝胶中呈现帮型的不同来判断被检测个体的因型。
5主要试剂配制
除另有规定，所试剂均为分析纯，水为符合（B/1S682的双蒸水（一级）：高座火菌条件为1.034×10°Pa压力.蒸汽灭菌2 min。5.1抗凝剂ACD
在700TnL水中溶解柠檬橙.8g、柠檬酸钠13.2%，霸萄糕14.7g，加水定穿1T高压灭菌。5.21risCl,1mol/L
在800mL水中解Tris121.1,用浓HCI调节pH垒8.0.加水定穿至1L:分装后高未火菌。5. 3EDTA(pII 8. 0),0. 5 mol/1.在70mL水中人乙一胺四乙酸二（ELA-Naz-2HO)18.6，加热剂烈搅并，用NaOH调节溶液的pII至8.0约需要2gNaOH).加水宗容荃100mI商压火菌。5.4血液DNA抽提液
取1mol/I. Tris·Cl 2. mL、0.5mol/T,FDTA(pH1 8.0)50mL.10% SDS12.5nL加[水容至250 ml..商压火菌，室温保荐。5. 5蛋酶 K,20 nmu/mL
胶蛋白酶K20mg溶于1mL灭菌双蒸水，20%冻存。5.6TE缓冲液(pII8.0)
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取1nul/I.Tris-C1(H8.0)10ml..0.5mol/LFDTA(H8.0)2mL水定穿至1L,高I下灭菌,室温保存，
5.7磷酸缓冲盐溶液(PBS)
在700 mL.水中溶解 NaC1 8.0g、KC10.2.Na2IIPO.1.44 、KH2PO.0.24 g用HCI调 H至7.4,加水定容系1L,高压灭菌·室温保存。5.8Tris 饱和酚(pH8. 0)
新蒸举，加人8-经基喔啉至终浓度0.1%，加入等体积0.5mal/LTris·C1（pH8.0)混合搅拌I5rin,两相分并后夫上层，用等休积0.1mol1/l.Tris·(1（pH8. 0)重复抽提至船相rH大于7.8.加人0.1体积含有0.2为统基艺醇的0.1mol/Trix.CI（pll8.0).保存于4%棕色瓶中并处于10mmol/I, Tris - (Cl (pH 8. 0)覆盖之下。5.9氯仿：异戊醇(24：1)
氯价和异戏醇获照体积比2：1泥合，家温封口则存。5.10酚：氯仿：异浅醇(25：24；1)、氯仿和异戊醇按照体积比25：24：1混介，保存于习C:棕色瓶中，并处于0.1Inol/1.Tris·C1(pH8.0)覆益之下
5.11乙醇,70%
取70mL无水乙醇加水定容至100m，20℃保存，5.12TBE缓冲液,10×
在700 nL水中解Iris碱108、硼酸55g：加人0.5mol/I.EDTA40nL.加水定容至1。5. 13TBE缓冲液,1×
取10×TBE缓冲液100mL，加水定穿至1L5.14TBE缓冲液,0.5×
取10XTBE缓冲液50mJ.,加水定密至！L。5.15溴化乙锭，10mg/mL
在10mL水中溶解溴化乙链100mg，按每1nl分装，4℃保存。汗意：澳化乙链是噪诱变剂并有中度毒性，使用个有这种染料的溶液时应戴上乎套，称盐对成戴口学。5.16聚丙烯酰胺凝胺，50%（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=49：1)在800tnl水中加人.内烯酰胺490，申叉双丙烯酰胺10，定容率1L。法意丙烯配按有毒性，配置和使用丙烯能胺溶滚时碰嫩手套，称量内烯酬按固径付成载口留5.17过硫酸铵，10%
在80mL水中溶解过峻铵10g,定容至100nl。5.18变性缓冲液
在9.8ml去离子币酰胺溶液中加人酚蓝2.5mg、二甲苯氧FF2.5mg、H油200uL,0.01mol/LEDTA200L，混勾分装，4C保存
5.19乙醇，20%
20mL光水艺醇，加水定穿至100l,5.20MNO..1%
取1mlHV加水定容至100 m。
5.21 AgNO,0.1%
0.1gAgNO.加水定容至100 mL.
5.22显色液
300 mL求加入无水碳酸钠6g、240uL币混勾，用时现配。3
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5.23乙酸，4%
取4乙酸，加水定容率100mL，
6主要仪器设备
6.1凝胶成像分析系统
6.2基因扩增仪
6.3高速离心机：12000r/min
6.4稳压稳流电泳仪
6.5单道可调移液：2，10μ,20100μ,200ul,1000gl6.6电子天平：量程0.001g100g，感量0.001g6.7紫外分光光度计
6.8恒温震荡器：0r/mim~200r/nin,0℃~6006.9电泳槽
6.10旋涡混合器
水平、垂直电泳槽
6.12高压灭菌锅：1.4×105Pa~~1.6×105Pa6. 13
3干燥箱：60℃
摇床：0/min~200r/mim
7检测方法
7.1样本采集
每只绵半颈静脉采血量为2mL~5mL.A（D（每6mL新鲜血液人1mLACm)或肝素钠(1）等抗凝。采血后，颠倒混匀以防山血液凝固，“20（冻存不超过2年。亦可采用其他方法收集样本。7.2DNA提取
冷冻血液代室温融化后.圾760L移至1.5TmI.离心管中，加入等体积PBS，充分泥匀，12000r/min离心15min，弃去上清液；再胺700ul.液移至同-离心管中，加人等体积PBS充分混勾，12000r/min离心J5min，存去上清液；再划人600μDVA抽提液，单悬沉淀物，加入蛋白酶K至终浓度为100/ml.，混勾，时口膜封口55℃过夜：将溶液冷郊至牢温，加人等体积本酚，绥慢地颠倒离心管10tmin，直至两相混合形成乳独液.12003r/min离心10min；取上清，加人等体积Tris饱和份，缓慢地颠倒离心管1Cmin，12000r/min离心13min；取上清：加人等体积份：氯仿：异必醇，缓慢地颠倒离心管10mir1，1.200r/rin离心10min；取上清，加人等休积氯仿+异戊醇缓慢地期倒离心誉10min12000)r/min离心10min;取上清.加人2倍体积的无水乙醇沉淀DXA，缓慢地转动离心管，可见自色DNA沉淀；12000/min短暂离心后除么元水乙醇，加%预冷的70%之醇洗2次，小心倾倒出乙醇；将装有DVA的1.5mT.离心管室温放置：让多余的2醇挥发，再加1501E级补没溶解，24h后置于一20保存。也可用相应市售DNA提取试剂盒提取DNA，亦可采用其他方法提取DNA。7.3DNA检测
取2uT.DNA溶液宵人微量离心管巾.用水稀释100倍，在紫外分光光度计260nm和280mm测定OT)值。INA浓度（u/μL）(L2值×10;DNA纯度=(D值/OD值。纯DNA的OD/O2比值应为1.8，若比值大于1.8，说明有RNA存在.应用RNA酶处理样品：若小丁1.8，说明样品中含有垒自质和酚.应刊用酚/氯仿抽提.以乙醇沉淀纯化工NA。7.4引物序列
7. 4. 1 引物1序列
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引物1用于RFLP检测，其预期扩增产物人小为11Ubp。序列为：上游引物为5'-GTCGCTAT-GGGGAAGTTTGGATG-3：下游物为5CAAGATGTTTICATGCTCATCAACACGGTC-3'。
7.4.2引物2序列
引物2用十SSP检测，其预期扩增产物大小为187bp。序列为：上游引物为5'-AGATIG-GAAAAGGICGCTATG-3：下游引物为5-ACCCTGAACATCGOTAATACA-3'。7.5PCR扩增
7.5.1PCR扩增体系
引物1和引物2的PCR扩增体系相。1CR扩增反应总体积为25uL，其中10×缓冲液2.μL(不含 Mg-),10 μmol/L 上下游号i物各 1.0 μL,2.5 mmoi/L dNTPs 2. 5μL,25 mnol/I MgCl: 1. 5pT.,50ng/uLDVA模板3.0uL,2.5U/μLTarDNA案合酶1ul去离水12.5ul.。7.5.2PCR扩增循环参数
引物1和引物2的PCR护增条件相同。PCR扩增条件：91%预变性5min；94C变性30，60C退火3C。72℃延伸30%；33个循环；72℃延神5min，4℃保存：也可很据不同的基因扩增仪对PCR扩增循坏参数做适当调。
7.5.3PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测引物1和引物2的PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电冰检测。7.5.3.11.5%琼脂糖凝胶制备
琼脂糖凝胶制备需要的装置有胶板、隔板、一次性于套、微波炉、三角瓶和多齿梳子等。先用水清洗制胶板，斯用0.5×TBE孙洗一次，水平放置：称取琼脂糖0.6g，辫解于10mL.0.5×TBE中：微渡炉加热煮沸，取出后室温放置降温，待温度降至约55℃时加人15uL溴化锭并混匀；将混介液缓慢倒入制胶板中，排除气泡，插入多齿梳子；约20mim后胶液凝固：拔出梳子后将凝胶转移至水平电泳中，往电冰槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。7.5.3.2PCR产物检测
ul.扩增物1ul[样缓冲液6×NALadingBuer),DNAMarkcrI(D.05mgDXA/mL）用量为4μl.：3V/em-3V/cm压，电泳20min~~30min用凝胶成像仪观察，并分析记录。7.6RFIP分析
7.6.1RFLI酶切体系
引物」的PCR扩增产物用AⅡ限制性内切酶进行酶切酶切反应总体积15，其中CR产物5μL.10×缓冲液1.510U/AⅡ限制性内切酶1.0，离子水7.5，振、暂离心（转速达12000/min即叫），划反应条件为37\℃水浴4h。7.6.2RFIP产物琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物用3.0%琼脂凝胶电泳检测。7.6.2.13.0%琼脂糖凝胶制备
3.C%琼脂糖凝胶制备时，应称玻琼脂糖1.2g，溶解于40mL0.5XTBE中凝胶制备步骤与7..3.1同。
7.6.2.2RFLP产物检测
5μL酶切产物加1μL上样缓冲液（6XDNALoadingEuffer),DNAMarker(0.05mgDNA/mL)用量为4μL，3V/cm5V/cm压，电泳25min-~35min；用凝胶成像仪观察，并分析记录。7.7SSCP分析
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7.7.1聚丙烯酰胺凝胶制备
聚内烯酰喽凝胶制备需要的装置有弹簧夹、试管架、坡璃胶板（平11和凹11）、一次性手套、多齿梳子、隔板(厚度一致攻者边缘较窄)、烧杯和玻璃棒等，用水必洗涤剂将玻璃胶板消洗十净后，用去离子水漂洗，置于室温下惊下（应洗净玻璃板，以确保灌胶时不会产生泡）；把平！玻璃胶极效在空的试管架上，隔板效胃在璃板的左、右两边和下边，确保隔极接触部位死链隙：再将带叫口的破璃胶板在间隔片上放置妥当，刘齐隔极，用弹箸夹将三逆夹位；将推备好的胶模斜靠在试管架上，呈45\角：胶膜开口向上。量取50%（49：1)的丙烯酰胺凝胶溶液7.2ml10×TIF缓冲液3.0ml10%过硫峻微C.21lTEMED10.5uL水19.59mL.共33I1混勾；将凝液缓慢凝注到胶模中！，确保凝胶没有气泡，立即将多齿梳子的齿侧插人凝胶济液中，硫了保持水半将胶板平放在试管架上，约：h凝胶避固成型：燥慢地从凝胶上移定梳子，增簧以及底部的隔板；经装到下槽感有1×TBE电泳缓冲液的垂直电泳槽上，用弹簧夹夹紧胶模，研保凝胶底部全部接触液面：在上槽中加1×TBE出泳缓冲液适量，以液而超过凝胶顶部0.cm为工，用注射器冲洗胶孔的底部，以除去多余的聚闪烯胺；连接垂直电神和电泳仪的正负极，接遥电源，15V/I恒定电压下出泳 5 min--10 min.
7.7.2聚丙烯酰胺凝胶电泳
吸取2μl.PCR扩培产物与7jL变性缓冲液混介；98变性10min，取fi后冰浴min完成变性，切断电泳植电源，将已变性的混个液用1oL的移液器准确点人每个胶孔中，静罩约10min，使样品全部下沉：然后接通电源，15V/crm恒定电压下电泳5min~10min，观察到识份蓝（深蓝色）和二举氛(蓝绿色）两条带分开后.5V/cm~7V/cm恒压，电泳16h。7.7.3银染
电泳结束后，将凝胶从电泳槽上卸下，小心将凝胶从玻璃胶板取出，切去一小角作为标记置小去离子水中漫泡,开启摇床，雅备银染。7. 7. 3. 1 洗胶
500 mL水澡洗,60 r/min305.
7.7.3.2固定
向漂洗过的凝胶中加人500mE.20%的艺醇：60r/min15min.用水漂洗：30s7.7.3.3氧化
加人5ml1%TN60r/nin3min，用水漂307.7.3.4染色
加入500ml.0.1%的AgNO，60/min30min，用水漂洗30s7.7. 3. 5显色
加入300ml2%的炭酸钠显色，50r/min约10min出现棕色条带，用水漂洗30s.7.7.3.6停显
加人500mL4%的乙酸60r/minmin，用水漂洗30s。保留条带，水平切去上下多余部分，将凝胶装人白封袋，鳍于广板上分辨其因型。8结果判定
8.1PCR扩增产物检测
引物1的扩增产物者仅出现b条带（图1），物2的扩增产物芳仪山现187p条带（图2期表示扩特异性好，可进行下一步检测，6
Swe：
8.2RILP检测
M.TNA mairter.T
1--9.PCR *物
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图1绵羊PCR扩增产物（引物1）琼脂糖凝胶电泳图谱（示特异性）3
：>89元
M.LNA marker [;
1~2: PCR严物。
图2绵羊PCR扩增产物(引物2)琼脂糖凝胶电泳图谱[示特异性M
用A.Ⅱ限制性内切酶对引物1的PCR扩增产物逆行酶切，不间个体结果应表现山3种感因型（BB,B+、一÷）之-（图3）。图3中的条帮1~3表示该绵羊为两个F拷贝的携带者（110bp/110bp），即B型：条带4～6表示该绵为个F\拷以的携带者（14bp/110p）即B+型：条带79表示该绵羊为Fec拷贝的非捞者(140bP/140bp），即「型。附
M: TNA marlert I;
4--6:BI 型;
7....-—型
图3绵羊PCR产物(引物1)的Ava亚酶切琼脂糖凝胶电泳图谱（示基因分型）8.3SSCP检测
对「物2的PCR扩增产物行SSCF分析，不同个休结果虚表现山3种跨阅型（BE、B十、1+)之（图4)：条带1~3表示该绵羊为两个FecF拷贝的携带者，即BB型，条帮4~6表示该缔羊为一个Fc2拷贝的携带者，即B十型；条带79表示该绵羊为Fecr拷贝的非撼带者，即i+型。9废弃物处理和防止污染的措施
检测过程中的废弃物应高压灭菌后再做处理，有毒有害废充物应经过除害再做处班.处理应符合环NYT1672
保耍求，
1-3-3
4 [3+型
7- 9 1 型.
图4绵羊PCR产物（引物2)的SSCP电泳图谱（示基因分型）检测过程中人员安全防护利防山交叉污染的措施按照GB/10915.和ST1193中的规定执行．
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