【农业行业标准(NY)】 畜禽微卫星DNA遗传多样性检测技术规程

ICS 65.020.30
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1673-2008
畜禽微卫星DNA遗传多样性
检测技术规程
Detection procedures of microsatellite DNA detection ufgenetic diversity for domcstic animals and poultry2008-08-28发布
2008-10-01实施
中华人民共和国农业部发布
NY/T 1673
本标准的附录A.附录B、附录C、闭录D、谢录E、附录F、附录G、附录H.附录1、附录J为资料性本标灌由中华人民共和国农业部畜牧业司提吊。本标准由全国畜牧业标雅化技术委员会心本标准起草单位：全国高牧总站今标准主要起草人：郑友民、张桂香、刘丑牛、王志刚、丁福清、孙秀柱、孙飞舟、赵俊金。1范围
畜禽微卫星DNA遗传多样性检测技术规程本标准规定广猪、牛，羊，鸡等畜禽微卫罡DNA遗传多样性检测的技术规程，NY/T 1673—2008
本标雅适用十猪、片、羊、鸡等畜禽遗传特性分析、遗传距离测定、亲缘关系分析等：2规范性引用文件
下列文件中的条款温过本标准的用而成为本标准的条款。凡足注日期的用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据木标准达成协议的各方研究是否可使用这此文件的最新版本。凡是不口期的引用文件，其最新版本适用丁本标准。GA/T383法庭科学DNA实验窄检验规剂3术语和定义
下列术语和定义适川于术标准.
微卫皇micrnsatellite
也称短串联重复序列或简单重复序（shortLantdlcenrepeats，STRs：simplescquencerepeats，SSRs)，以1bp~6hP的短核首羧序列为H本单位，呈中联更复状敬在分布丁生物体基因纠中。3.2
座位locus
基因在染色体上的位嘴称为座位。3.3
等位基因频率allelefreguency
给定座位「某等位基因所占的比例。3.4
遗传杂合度heterwyousityl
群体中某个座位为杂个子的比例，用于衡量标记方式的信息含量程度。3.5
平均遗传杂合度averageheterozygosity反映群体在多个基因座上的邀传变异程，3.6
多态信息含量polymorphisminformationcontent，Pic在某一群体中可以利移念性遗传标记作为逆传标志进行基因连锁分析的概率，既利用此多念性遗传标记在群体中进行基因诊谢的诊断率。等位基因数目越多，等位基因频率分布越均勾，多态信息含最越大。
遗传分化系数coefticicnt of gene ditferentiatian,Gs反映群体的分化程度，其值在0～1之间。多座位时，平均基因分化系数是所有座位的成内分化系数的算术平均值。
Y/T1673-2008
遗传距离genetic distance
衡量群体间若下性状综合跨传差异大小的指标：按多元统诈分析方法计算品种问客个性状基因型值构成的多维空间的儿何距离，就叫作群体间的遗传跑离。主要的遗传距离分析方法有：Ni氏标准遗传距离（Nei'sstnndard.genetiedistaccD）Nci遗传所离（Nei'sgenelicdislancc，D）3.9
聚类分析cluster analysis
用数学方法来具体而形象地措述形体之间的关系的科学。主要有非加权组对算术平均法聚类分析(unwcighred pair group cthod with arithmetig mecan，LIMA）和邻近结合法聚类分析（ncighhorjoining method.NJ).
4原理
微卫星山核心序列利两侧的侧翼序列所构成，谢翼序列使微了星特异地定位于染色体某一部位，核心疗列重复数的差异则形成卫基高度的多态性。若某个体激因组中某个微卫星再复单位数相等，该个休在该座位的湛内型为纯个了，否则为杂合手，检测力法是针对微下星两端的侧翼序列设计可引物，对模板DNA进行PCR扩增，根据结果判断个休基因型，逃行统计分析。5检测方法
5.1检验样品的采集和保存
5.1.1采样个体应具备该品种的典型特征，每品种采集要求一代内光血缴关系的斋禽个体不少平60头（只）,其中雄性数量不少丁%。5.1.2详的采集及保存应满足提取DNA的要求，并详继记录材料名称、水源，系谱、采集时闻，地点及保存条件。
5.2样品DNA的制备
样品DNA的制备方法见附录A，名样品试剂配方配附录B5.3引物
5.3.1引物选择
宜使用FA(ISAG联合推荐的一套门十密离微卫岸XA遗传多样性检测的标记，参见附录C、附录 T.附录E、附录 F、附录G,附录 H.5.3.2引物合成和配制
将引物管进爆时离心，加人火菌超纯水后充分震荡，配成浓度为1o！pnaal/u工的储液，穿温溶解30min分装，20保行。储液稀释50倍以后即为作液。其中.人次菌超纯水的体积V(u)按式(1)计算：V...33XODX10m
式中：
V—-加人灭菌照纯水的体积,单位为微升（uI.)；Mw
引物芬广量，
（D—引物T)NA的浓度，即A/A比值，由合成引物的公司提供：注：对于双链DNA来说，1OD相当于59ug/nL5.4PCR反应体系bzxZ.net
PCR反应总休积均为5，体系中客成分的用量见表1，2
Buffer裴1微卫星标记PCR反应体系
单座位PCR反应体系
MgCl, (25 mTol/ L)
引物P：A(2ol/L)
引[物 P,B(2 prmol/ μL)
dNTPe(25 tuinol/I)
Taq F(5 U/ μL)
5.5PCR反应程序
0. 9 μlr~2. 0 u.
0. 8 μ~2. 0 μT,
0. 8 ul---2, 0 μl.
C. 12 uL--0. 15 uL
c.2 μrl.
50 rg-~-00 ng
Bufer(1ox)
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双座位PCR反应休系
MgC1, (25 mrul/ L)
引P.A(2ml/L)
PB(2 pmol/L)
引物PA(2pmol/)
引物PB(2pmol/)
dNTPs(25 rutr:cl/ 1.)
Ta E(S L/uL)
dH川至
0.0-2. 0l
0. 8 p,~2. 0 μml.
0. 8 山~-2. 0 g
0. 8 pL---2. 0 rL
0. 8 rL-~2. 0 μ1
0. 23 ,μL~0. 18 pL
50tg~-10cng
PCR反应使用的程序见表2.关于每个座位的详细退火温度参见附录C、附录D、附求E、附录F.附录G、附录 H,
表 2微卫星标记ICR反应程序
5.6扩增产物的检测
扩增产物的检测方法参见附录1.附录J，5.7基因分型
59℃65℃
25个~%个循环
4保存
20 5~60 5
30s~-605
30 5-~60 5
13 min--79 min
利用凝胶成像分析系统进行分析，极分了量标记物的大小标楚检测片段的大小。确定等位基因的原则是：片段大小基本在已报道的范围内；条带消晰：纯合子只有条带，杂合子具有两条带，且两条带的着色深浅基本一，不清楚的带型重新扩增检测。6数据统计分析与判定
等位基因频率P
等位基因频率力；按式(2)计算：p:=P+
某一等位基因的频率：
P一含有谋等位基因的纯合子的频率，H
含有荣一等位基因的杂合了的频率。6.2哈代-温伯格平衡检验
哈代-漏伯格平衡检验按式(3)计算：2
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O基因型：的观察频数
E—基因型i的理论频数；
为基因型的数目。
自出度df1。
6.3选传杂合度和平均遗传杂合度6.3.1遗传杂含度按式（4)让算
当--个标记位点的w个等位些因的横率分别为P，、P…时，h
2平均遗传杂合度接式（5)计算：6,3.2
检测的虚数：
第个座位第主个等位基因的懒率；第，座位的遗传杂合度。
6.4多态信息含量的计算与判定
6.4.1多态倍息含量PIC按试<5)计算：PIC.1
力-第i个等位基因的颁率；
P第了个等位基因的频率；
该率位的等位基因数。
6.4.2多态信息含量的判定
一般求说当P0.5时，该座位为高度多态：0.5P10.25时，为中度多态IC0.25时，为低度多态
6.5基因分化累数的计算和判定
基因分化系数Gsm按式(7)计算：Gsr
其中：
…所测鲜体的畜禽个体总数；
第个群体在某标记位点上第个等位闪的频率，m
该座位的等位基因数；
第i个群体在该座位上的等位基因数；该座位上第了个等位基因在总群体中的平均顺率。多座位时，平均些因分化系数是所有座位的基因分化系数的算术值。(7)
6. 6Nei 氏标准遗传距离 Ds
Nei氏标准遮传距离D,按式(3)让算：其中：
D, --Ix().
I J/(1)-2
式中：
X雌休中第，个座位上第2个等位基因的频率：X
Y—-Y群体中第，个幽位上第：个等位基闲的题率：m,一第于个座位上的等位基因数；检测的虚位数。
6.7Nei氏遗传距离Da
Aci氏遗传距商.按式(9)计算：
Da i-
式中：
X，\-X群体中第，个座位上第个等位基因的题率；Yi
-Y群体中第，个座位上第：个等位基的题率；n,
第，个座位七的等位基因数；
检测的座位数
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6.8非加权组对算术平均法聚类分析和邻近结合法骤类分析应用软件进行教据分析，可采GENEPOP计算基因赖率，DISPAN计算遗传杂合度，遗传距离以及聚类分析，采用Bootstrzp检验可检验所得系统发生树的可靠件，般认为，Doo饮Bortstrap抽样而分数在60以上时，认为此次聚类结果比较可靠。7防污染措施
遵照CA/T383规亲的方法执行。
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A.1DNA样品的制备方法
A.1.1从血液中提取基因组DNA
附录A
【资料性附录】
样品的制备
A.1.1.1取适量IL液加人等体积血样裂解液，加人RNA酸至终涨度为20g/mL.充分混勾，37C消化1h--2h.
A.1.1.2加人蛋白酶K至终液度为100μg/ml,混匀,55℃水浴消化12h至不见有黏稠块。A.1.1.3加入等体积T\is他和，反复颠倒离心管，使两相溶液充分混合形成乳浊液，4℃12000r/iin离心1min;小心吸收上清液转移荃另洁净的离心誉中。A.1.1.4量复一次A.1.1.3的T作。A.1.1.5加入等体积的份！氯仿：异戊尊（25：21：1)混合液，缓慢颠倒离心管，使两溶液充分混台,412 000 r/min离心15 min。4.1.1.6加入等体积氯：异戊醇（24：1)混合液，缓慢顾倒离心管，使两相游液充分混合：4%12000r/min离心1mi1;小心收集上清至—离心管中。4.1.1.7将上清液吸全较大容量的试管中加入1/10体积3m>1/1.NaAc溶液(pH5.2)利2.5倍体积的预冷尤水乙醇，轻轻择动试管至出现白色絮状DNA沉淀。A.1.1.8将1DVA沉淀转移到1.5mL离心管中，用75%2.醇洗涤2次。A.1.1.9将DVA+燥后加人适量TE级冰液或灭菌双蒸水室湿溶解24h：A.1.2从组织中提取基因组 DNA
A4.1.2.1取0.3左右组织背于1.5mL离心管中，眼科于术剪剪痒。A.1.2.2晾干后加入500证织DVA提取液，然后加人RNA酶至终浓度为20/ml.充分混勾，37℃消化1h，
A.1.2.3蛋片游K至终浓度为150g/mL200ug/mL，充分摄匀，55C水浴消化过夜12h以上，至不见组织块。
A. 1. 2. 4 以 下步骤同 A. 1. 1. 3-A. 1. 1.9。A.1.3从毛发中提取基因组DNA
4.1.3.1用灭术双蒸水洗涤毛发，然后剪成0.3cm~9.5cm，常于1.5mL离心管中。A.1.3.2惊T后如人30L-~50μL组织TNA提取液，然后加人岱凹K至终浓度为200u&/ml,充分混匀，55℃消化至完金溶解。A. 1. 3. 3 以下步骤同 A, 1. 1. 3--A. 1. 1. SA.1.4从精液中提取基因组NA
A.1.4.1每个休取冻精3支或鲜精0.1ml.置于1.5ml.离心管中A.1.4.2加等量精子洗涤液，4500T/min离心Gmi.奔上清A.1.4.3重复洗涤精产沉流2次，去掉其中的卵黄甘洲等物质。A.1.4.4用0.1ml.精子裂解液重悬沉淀、A.1.4.5加入强白酶K率终浓度为100μg/m.混勾后55℃消化过夜至少12h。A.1.4.6以下步骤A.1.1.3~A.1.1.9。A.2INA质量检测
A.2.1吸出适量取的NA，进行电冰检测，DNA必须条带整齐，未见明显降解。NY/T1673—2008
A.2.2吸出适量提取的DNA，酌情稀释，用生物分光光度仪检测DVA的浓度（OD)，根势测定结果出将DNA溶液稀释垒预定值。较纯DNA样品的A2En/As比值为1.8左右；荞该比值人人低」1.8.说明伴品叶含有较多的张质.需要进步纯化。DNA 浓度按式(A.1)计算：
DNA浓度(p/mil)=MXOI)X5a
式中：
M-稀释倍数；
ODDNA的浓度，即Aa/Ac比值
注：对于双链DNA来说，1（D当于E/ml(A. 1)
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B.1血液裂解液
地液裂浓能制见或B.1.
行液浓度
1 mo./ L Tri- HC:pH8. 0)
0. mo:/ L EDTA(pH8. 0)
10% sDs
火菌双燕水洲室
B.2组织DNA提取液
红织DNA提取液配制表B.2。
（资料性谢录）
试剂配制
泄存液液度
I ma./ L Tris- IICl(pHa. 0)
. 5 moi/ L EDTA(pH8. 0)
0. 5 noi/ L Nacl
1CK SDS
火菌双紫水加至
B.3精子裂解液
稍子裂解液配制见表B.3
血液裂解液的配制
体积,ml
组织NA提取液的配制
体积,
粉子裂解液的配制
存波浓压
1 mol/ITris-HCl(pIJ8.0)
c. 5 nol/L. FTEApl8.o)
u. h mal/I. Nac!
1m/用现
灭菌双蒸水加至
B.4精子洗涤液
休积,ml
使用浓度
10nesl/
100l/1
使川浓度
50mmol/1.
1aGrumol/L
100mmol/1
使用浓度
10 zumo/L
15 reme:/1.
ICO mmol/L
39 punl/1
取1mol/1的NaCl37.5rnL0.5ol/L的EI)TA5mL，加双蒸水至250mL。高压灭菌备用。8
B.5蛋白酶K贮存液(20 mg/ mL)
200蛋自酶K溶丁10mL.灭菊双蒸水中，分装，每管1mL，一20℃冻存，B.6TE缓冲液(pH8.0)
10mmol/LTris-HCl(pII8.0),Immol/E.EDTA(pHS.0)B.7电泳缓冲液
1XT2is Z酸(TAF):0. 0i mol/L Tris -(腋,0. Ixl/L EDIA.0. $X Tris -硼(TBE):0. 045 IIml/L Tris -硼酸,0. 01 mol/L EDTAB.8溴化乙锭溶液（EB10mg/mL)
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用少员双蒸水溶解】多溴化7锭，磁力搅抖数小时以确保具光伞浒解.定容至10mT.然后转移到棕色瓶哦铝箔包艇容器中，室温保存注：被化艺键足强诱变剂并有中度毒性，似含有这种染料的率液付务必嫩上手套，称底染料时要戴口罩。B.96X上样缓冲液
0.05%溴酚蓝，0.12%.：中茉克FF40%（W/V）燃水溶液：或0.05%浪酸蓝，0.12%二甲苯背FF.30%V/V)书洲水溶液，
B.101mol/L二硫苏糖醇(DTT)
用20ml.0.01mol/L乙摄钠溶液（plI5.2)溶解3.09gDTT，过滤除菌后分装或1mL必存于一20℃。注意：DTT或含有1T的游液不能逆行高压处理。B. 111 mol/L Tris(p118. 0)
将121.1gTris」800mL水中，加浓盐酸调pEI率8.0.定穿至1000L后高压火菌B.120.5mol/LEDTA(pI18.0)
将186.1NaEDTA·21I0加人800m1.水中，加人Na01I约20)g调pH率9.0.定容后高压灭茵.
B.1310%SS[500 mL)
将50多SDS加人00mI.水中，60C加热溶解，宠容后划滤除菌，B.1430%丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=29：1)200mI.水中溶解285内烯酰胺15gH双双丙烯酰胺，定容垒1L，4℃保存.B.1510%过硫酸铵（APS）
8mL水中溶解1过硫酸铵，剂水至10，4℃保存B.16pGEM-3Zr(+)/ae亚与PIR322/MspI的等量混合分子量内标两种内标各取20αl.加人580μL灭菌双蒸水，再加入120μl.上样缓冲液，充分混勾，每次上样8μL~-10gl.
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80名单饹酸钾济下1.000mL蒸馏水中，搅拌溶解后，缓慢加人100μL浓硫酸，小心混合均勾。注意需带防酸手套携作..
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