【农业行业标准(NY)】 猪雌激素受体和卵泡刺激素β亚基单倍体型检测技术规程

ICS65.020.30
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1670—2008
猪雌激素受体和卵泡刺激素β亚基单倍体型检测技术规程
Detection procedures for haplotypes of estrogen receptor &follicular stimulating hormone beta subunit gene in pigs2008-08-28 发布
2008-10-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准的附录A为规范性附录，附录B、附录C为资料性附录。本标准山中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标准由全国畜救业标准化技术委点会归口：本标准起单位：全国密牧总站、中国农业大学。本标准上要起草人：李宁、工志刚、刘丑生、张柱香、满清、韩旭、孙秀柱Y/T1670—-2008
1范围
猪雌激素受体和卵泡刺激素
B亚基单倍体型检测技术规程
AY/T1670--2008
本标准规定广猪雌激素变体(ESR)和卵范刺激素B亚基(FSH)基因单倍体型检测规程。水标准适用丁猪ESR基菌型和FSII基因型的单独或合并定性检测。2规范性引用文件
下列义件中的条款通过本标雅的引而而成为不标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于水标准，然而，鼓励根括本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不准日期的引用文件，其最新版本适用于木标准。GA/T383法庭科学DAA实验室检验规池3术语和定义
下列术讲和定义适用于本标摊。3.1
限制性片段长度多态性
restrietionfragmentlengthpolymorphism,RFLp以限制性内切酶处理D>A产生的片段长度变化为依据的一种遗传标记4原理
确激素受体基因是控制猪产仔数的主效某因之一，ESRBR基因型与产了性状呈正相关，AA和AB基网型个体的产仔性状次之，FSR基因座等位涉闪的差异是由于B等位其因发生点突变，从面产生个PmT限制性酶切位点。卵泡刺激索B亚基（FST-TB)垫因也是控制猪产存数的主效基因之一FSHBBB基因型与产仔性状呈正相关，AA和AB基阅型个休的产行性状次之。猪FSHB基因等基因的差异是出于A等位基因在FSH3基因的第1个内命予中存在1个292bp的逆转座了插入突变（A等位基因扩增片段为500 bp.B等位基因为218 bp)。ESR 和FSH3BI3-BB单倍体型与产存性状呈正相关，其他基因型个体的产仔性状次之。为广同时选择同效应某因型，针对FSR基因和FSIT3基因的侧翼设计引物，进行扩增，通过检测带型分布鉴别猪个代ESR和FSH9单倍型。5试剂和仪器设备
5.1试剂
以下试剂无特殊标注均为分析纯。5.1.1血液裂解液、组织T)NA提取液和精子裂解液。5.1.2 Tris 饱和酚:重蒸。
5.1.3氯中烷。
5.1.4异戊醇。
5.1.5无水乙醇。
5.1.6溴化乙锭(10mg/mL)。
NY/T 16702008
5.1.7TBE或TAE电冰缓冲液。
5.1.86×上样缓冲液。
5.1.9琼脂糖。
RNA酶(10mg/mL)。
5.1.11蛋白酶K(20mg/ml)。
5.1.12、无水炭酸钠。
5.1.13dNTPdATPdCIP,dII和dTIP5. 1. 14Tag DNA 聚合酶(3 U/ μL),5.1.15限制内切酶PcrmuT（10 L/ul.)5.1.16TNA分了量标记。
5. 1. 17试剂的配方和配制现随录 A5.2仪器设备
5.2.1避胶成像分析系统..
5.2.2PCR折增仪
水平电泳槽。
离心机，
，涡旋震裁器。
可调移液器。
稳压稳流电仪。
超净1作台
5.2.9超纯水器。
5.2.10 高压灭菊器。
6检测方法
6.1样品的收集与保存
6.1.1采样个体应具备该品种的典型特征，短品种采集要求“代内无血缘关系的个休不少于60头，其中雄性数量不少了10治。
6.1.2样品的采集及保存应满提取工)NA的要求，并详记录材料名称、米源、系谱、采集时间、地点及保存案件
6.1.3DNA样品的制备与检测参见附录B3。6.2引物合成和配制
6. 2. 1引物序列
ESR引物序列
上游引物FI5'-CCTGTTTTTACAGTGACTTITACAGAG·3F游物RI5CACTTCGAGGGTCAGTCCAATTAG3FSI3引物序列
上游引物F25'-ACTGGTCTATTCATCCTCTC-3'下游物R25-CCTTTAAGACAGTCAATGGC-3将引物管进行概时离心，加人炎菌双蒸水充分震落5min~10main，室温充分落解30min，分装：20%冻存.
6.2.2灭菌双蒸水的加入量
火菌双蒸水加人景的计算按式(1)计算：戏中：
V-—加双蒸水的体积，单位为微升（uL）；OD X33
引物DNA的浓度，即A20/A网比值，由合成引物的公司提供：O
C引物浓度，单位为100pmo1/u，一般配成700mal/贮存液：w
合成引物的分子量.
6.3PCR反应程序
NY/T 1670 2008
91℃预变性1min，然后进行30个35个循环的扩增反应，每个循环括91℃变性30s~60s，55℃~-60℃退火30s~45%，72℃聚合30s~60s，72℃聚合延伸10mi1,4℃保存。6.4PCR反应体系
PCR反应总体积均为25u,体系中各戒分的用量见裘1表 1 PCR 反应体系
组分及被度
1oxbuffer
MgCl (2: mmol/ L)
dNIPs(2. b mmol/ L)
上游引物F(10(μmol/,L)
上[物F2(10 jnl/μ.
下游引物R110l/
下引物R210l/
LINA模板
Tar DNA案合
火菌效蒸水川至
6.5电泳检测PCR扩增产物
使川量
1. 5 μl,~-2. 5ul
1. 5 μL ~2. 5 ul.
0. 4~.. 25μ
0. 5 μut.-1. 25 μL
0. 4 1. ~-1. 25 μul.
. 5 grl.--1. 25 μul.
50ng~100
1. 0 U-~2. c t
制备1%~3%骤脂糖/TEE（或TAF)凝胶。取5μL扩增产物，与上样缓冲液混合后电泳，检测PCR扩增日的基因片段是否成功以及产物长度：PCR扩增产物长度应为120bp和/或218bp300bp6.6RFI.P检测
6.6.1扩增产物的RFLI反应体系见表2。表2扩增产物的RFLP反应体系
海闭组分及浓度
1uxhuffcr
PnI限制性内切降10mL)
PCRp物
灭菌双燕水伞
使用量，
6.6.2反应休系中可加入适量乙酰化BSA。泛应体系混含均匀后.37℃消化4h以上。6.7对照实验
谢次实验必须设置阴性对照、阳性对照和空白对照。7单体型检测与判定
7.1单体型检测
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制各2%~4%琼胎糖/TBF(或TAE)凝胶，凝胶含0.5μg/I.澳化乙锭(EB)。取适量上样缓冲液和酶划产物混个后电泳。电泳结束后，将凝胶留丁凝胶成像仪上，拍照节型分布。7.2单体型判定
ESR-FSHB单体型判宗见表3.参考图片参见附录C表3FSR~FSI单体型判定
产物长度，p
ESR单体型
注意事项
Fs单体
ESR单体型
FSHi尊体型
FSR-FSH9单体测
限制性内切酶的活性要高，每次反应加入的酶量要充足，个则，会导致PCR产物的不全消化，进误判基因型。
结果表述www.bzxz.net
XXX猜ESR单借体型为AA型；
XXX猪ESR.单倍体型为AB型：
XX猪 ESR单倍体型为 BB型
XXX猪 FSHIB单猎体型为 AA 型：XXX猪FSI单倍体型为A出型：
XXX猪FSHB单倍体型为BB型：
XXX精ESR-FSH3单倍休为BE·EB型；X×X猪ESR-FSH3单倍体型为13T3-AB型：XXX猪ESRFSH3.单倍体型为BL-AA型；×××猪ESR-FSH3单倍体型为ABBB型；XXX猪 ESR FSII3单倍体型为 AB-AB 型:XXX猎 ESR FSII3.单倍体型为 AB-AA型;XXX猎FSR-FSH3.单倍依型为AA-BB型；XXX猪ESR-FSH3单倍体型为AA-AB型；XXX猪ESR-FSH3单倍休型为AA-AA型。10防污染措施
参照GA/T383规定的本法执行
A.1试剂的配方
it液裂解液配方见表A.1.
贮存液浓度
1 rml/I. Tris - HCl(pH8. c)
0. 5 mol/L EDTA(pHS. 0)
10% SDS
灭菌双蒸水亲
附录A
【规范性附录】
试剂的配方和配制
A.1.2组织DNA提取液配方见表A.2%血液裂解液配方
朱积mL
表4.2组织DNA提取液配方
实存报谦度
I moi/ L Tris - HCl(pH8. 0)
C. 5 mol/I. ETA(pH8. 0)
0. 5 mol/L NatCl
灭幽双蒸水加至
A.1.3精子裂解液配力见表A，3。汇行液浓度
1 moi/L Tris-HCi(pH18.0)
G. 1l/I. EDTA(pH8. 0)
d. 5 ml/1. NeC]
10%SDS
1mol/L.TT
灭双水加
A.2试剂的配制
A.2.1精子洗涤液
体积，nl.
表A.3精子裂解液配方
体积，ml。
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使用浓度
l0nci/1
Ioomnol/L
使用浓度
> mrol/1
10crmol/I.
1cc unl/1
凝而浓度
10 nnol/L
10 mnal/1.
39 umo./L
取37.5ml1mol/LNCl,5mlL0.mal/LEIYTA,加双蒸水至250mT高压灭菌20min，备A.2.2蛋白酶K贮存液(20mg/mL)
200tng蛋白酶K济于10mL灭菌双蒸水中，分装，每管1.mL，一20℃冻存。A.2.3TE缓冲液(pH8.0)
10mmoi/T.TrisHCl(pH8.0),1mmcl/1.FDTA(p8.0)A.2.4电泳缓冲液
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50XTris-Z酸TAE.pH8.5):242gTris碱.57.1mT.冰醋俊,37.2gNaaEDrA2H,0,冰至1.
10XTris-潮酸(IBE.pH8.0):108 Tris-碱,55 g 硼酸.40 rmL 0. 5 1ol/L EDTAA.2.5溪化乙锭溶液（EB.10mg/mL）用少量双蒸水溶解1溴化乙链，微力搅拌数小时以确保其完全溶解，定容至10gml，然后转移到棕色瓶或铅箔包裹容器中，究温保行注：浪化乙健是强诱安剂并有中度毒性，使门时溶液务必鼓上于套，称量染料时要鼓！草。A.2.66×上样缓冲液
0.05%滤份蓝，0.05%一叫克FF，40%（W/V>照糖水溶液：或0.05%溴晰临，0.03%一中辈背FF.30%（V/V)甘油水溶液
A.2.71mol/1.二硫灌醇(DTT)
用20tnL0.011ol/I.乙酸纳溶液(pT15.2)溶解3.09gDTT，过滤除菌后分装成1ml.贮存于20%
注:TTT或含有ITT的济液不能进行商压处理。F.
B.1DNA样品的制备
B.1.1从血液中提取基因组DNA
附景B
【资料性附录】
DNA 样品的制备与检测
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B.1.1.1最适量血液加人等体积血液解液加人RA酶至终浓度为20/ml，充分混，37%消化1h~-2h:
B.1.1.2加人蛋白酶K至终浓度为10g/mL.混匀.55℃水浴消化12h至不见有数稠的团块。H.1.1.3加人等体积Tris饱和晰，反复颠倒离心管，使两相落液充分泥合形成乳浊液：4℃120001/min离心15min;小心吸取上清液转移至另一消次的离心管巾。B.1.1.4重复一次B.1.7.3的工作。B.1.1.5加人等你积的龄：氯伤，异成醇（25：24：1)混个液，缓慢颠倒离心管，使两相溶液充分混合，4℃12000r/nin离心15mir
B.1.1.6加入等体积氮伤：异戊醇（24：1)混合液，缓慢颠倒离心管，使两相溶液允分混合：4℃12000r/min离心15min；小心收集.上清至刃一离心管中。B.1.1.7将.上消液吸取至较大容最的试管中,加入1/10体积3mol/LNaAc溶液(pH3.2)和2.倍体积的预冷无水乙醇，轻轻搁动试管至出现门色繁状DNA沉淀。B.1.1.8将DNA沉淀转移到1.5mL离心管中,用75%乙醇洗涤2次。B.1.1.9将DXA干燥后灿入适量TE或灭菌双蒸水溶解。B.1.2从组织中提取基因组DNA
B.1.2.1取0.3g组织置于1.5mL,离心管中.用限科于术剪前碎B.1.2.2灿人500L组TNA提取液.然后加入RNA酶至终浓度为20μg/ml，充分混匀，37℃消化1h～2 h。
B.1.2.3加蛋K至终液度为150μg/mL-~200μg/1mL：充分混勾，5s%水裕消化过被，B. 1.2. 4 以下步骤同 B. 1. 1. 3~-B. 1. 1. 9。B.1.3从毛发中提取基因组DNA
B.1.3.1用灭菌双蒸水凝涤毛发，然后剪成0.3cm-~0.5cm置于小离心管中B.1.3.2晾于后加人30uL~-50uL.组织DVA提取液，然后加入蛋白酶K系终浓度为200g/mI.,充分混匀，55℃消化至完全溶解。B.1.3.3以下步骤同B.1,1. 3~~B.1.1.9.B.1.4从精液中提取基因组DNA
B. 1.4.1每个体取冻精 3支或鲜精0.4 mL,置了1.5mL离心管中。B.1.4.2加等量精子洗涤液.±500r/min离心6min，奔上清。B.1.4.3量复洗涤精子沉淀两次，去撑其中的卵黄凸油等物质。B.1.4.4加0.4mL,精子裂解液重悬沉淀。NY/T1670—2008
B.1.4.5加入蛋白酶K至终浓度为100ug/ml.混合后于55℃消化过夜至少12hB.1.4.6以下步骤同B.1.1.3~B.1.1.9B.1.5也可用等效DNA提取试剂盒、碎珠法，Chelex法、CIAB法(十六烷基一基漠化胺>等方法提取基因组DNA.
B.2DNA样品质显和浓度检测
取适量DNA辫液·啊情释，然后检测IAA浓度，根据测定结果再将DXA溶液稀释至预定。较纯TNA样贴的A20/A25比值为1.8左4，若该比值大大低于1.8，说明样品中含有较多的蛋由质，需娶逃一步纯化。
附景C
（资料性附录）
基因型判定参考图
C.1FSH3其闪PCR扩增结果中泳图见图C.1a
FSHP器内呈现PCR扩增象态，分种利基因塑：AA，A1、IB我道1:MARKER；
泳道2：底性对度
泳简3空内对照：
泳道？：AA(500bp）：
冰道10:A5C218）
泳道43.5.8.9,11.12:DB(219bp)。810
图C.1FSH基因PCR扩增结果电泳图C.2FSR基因PCR产物酶切结果电泳图见图C.2,1
泳道1，MARKER；
泳道12BH(120bp））
泳2.0.?,8.10:AAC120bp+65hp/$5bp;道3.4.12.13.A(fp5p).
图C2ESR基因PUR产物酶切结果电泳图120bp
NY/T1670—2008
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