【国家标准(GB)】 鱼类检疫方法 第3部分：病毒性出血性败血症病毒(VHSV)

ICS65.020.30
中华人民共和国国家标准
GB/T15805.3—2008
部分代替GB/T15805.1-1995
鱼类检疫方法
第3部分：病毒性出血性败血症病毒(VHSV)
Quarantine methods of fish-
Part 3: Viral hemorrhagic septicemia virus(VHSV)2008-07-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
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2008-11-01实施
中华人民共和国
国家标准
鱼类检疫方法
第3部分：病毒性出血性败血症病毒(VHSV)
GB/T15805.3-2008
中国标准出版社出版发行
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开本880×12301/16
印张0.5字数9千字
2008年10月第一版 2008年10月第一次印刷*
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书号：155066：1-34022
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http：//foodmate.net前言
GB/T15805《鱼类检疫方法》分为下列部分：第1部分：传染性胰脏坏死病毒（IPNV)；-第2部分：传染性造血器官坏死病毒（IHNV）；—第3部分：病毒性出血性败血症病毒（VHSV)；第4部分：斑点叉尾鲷病毒（CCV)；第5部分：鲤春病毒血症病毒（SVCV)；第6部分：杀鲑气单胞菌；
一第7部分：脑粘体虫；
本部分为GB/T15805的第3部分。GB/T15805.3—2008
本部分代替GB/T15805.1—1995《淡水鱼类检疫方法第一部分》中的第5章。本部分与GB/T15805.1一1995的第5章相比主要变化如下：分离病毒的细胞由原仅用RTG-2改为用FHM或RTG-2细胞分离。因为最适合VHS生长的细胞是FHM和RTG-2。OIE的诊断手册也是推荐这两种细胞。对一些过时的试剂和设备进行了修改，并纠正了一些印刷错误。结构格式按GB/T1.1一2000的规定，作为部分编写。本部分的附录A为规范性附录。
本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会归口。本部分起草单位：农业部全国水产技术推广总站、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本部分主要起草人：孙喜模、江育林、陈爱平、陈辉、朱泽闻。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：-GB/T15805.1—1995。
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1范围
鱼类检疫方法
第3部分：病毒性出血性败血症病毒(VHSV)
GB/T15805.3—2008
GB/T15805的本部分规定了用细胞分离病毒和用中和试验鉴定病毒性出血性败血症病毒（VHSV）的方法。
本部分适用VHSV的分高利鉴定，VHS的流行病学调查、诊断、疫情监测，以及口岸出入境、国内CHIN
跨区域移动的检疫。
规范性引用文件
下列文件中的条款通过GB/T15805的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文
件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T668
GB/T180
试剂和材料
分析实验室用水规格和试验方法（neqISO3696：1987)水：GB/T
-1992，二级
VHSV参考
：由农业部指定的动物病原微生物菌（毒）种保藏机构提供。海林
阴性对照：正常细胞组织悬液
病毒参考抗血清
仪器和设备
普通冰箱和低温冰箱
离心机和离心管。
天平。
细胞培养瓶和96孔细胞培养板
倒置显微镜。
微量移液器及吸头。
恒温培养箱。
组织研磨器。
剪刀，镊子。
VHSV的分离
按GB/T18088一2000的规定执行。对有临床症状的鱼，体长<4cm的鱼苗取整条，若是带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊；体长4cm～6cm的鱼苗取内脏（包括肾）：体长大于6cm的鱼则取肝、肾、脾；对httn：//foodmate.netGB/T15805.3—2008
无症状的鱼取肝，肾、脾，成熟雌鱼还需取卵巢液；鱼卵则取卵壳。5.2样品处理
应在10℃以下进行。先用组织研磨器将样品匀浆。再用培养液（见第A，1章）按1：10的最终稀释度悬浮。在匀浆前未用抗菌素处理过的样品，则须将样品匀浆后再悬浮于含有抗菌素（1000IU/mL的青素和1000μg/mL的链霉素或其他抗菌素）的培养液中，于15℃下孵育2h～4h或4℃下孵育6h～24h。7000r/min离心15min，收集上清液。卵巢液不必勾浆，稀释两倍以上。用相同的方法离心卵巢液样品并在以后的步骤中直接用其上清液。5.3分离操作
对上述1：10的组织匀浆上清液用培养液再作两次10倍稀释，然后将这1：10、1：100和1：1000三种稀释度的上清液，以适当体积分别接种到生长约24h的RTG-2或者EPC的细胞单层中，每孔（2cm2）的细胞单层最多接种100μL稀释液。15℃～18℃吸附1h后，加人细胞培养液。置于15℃～18℃培养。
阳性对照组和待测样品都接种细胞后，7d内每天用40倍到100倍倒置显微镜检查，接种了被检物匀浆上清稀释液的细胞培养中是否出现细胞病变（CPE）。空白对照细胞应当正常。如果阳性对照细胞出现了CPE，而待测样品中没有CPE出现，则在培养7d后还要用敏感细胞进行再传代培养。传代时，冻融并收集接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物。7.000/min，4℃离心15min，收集上清液。接种到新鲜细胞单层，培养7d。每天用40倍到100倍倒置显微镜检查。如果样品经过接种细胞和盲传后均没有CPE出现，则结果判为阴性。如有CPE出现，则要用中和试验进行鉴定是否由VHSV引起。
如果阳性对照组也未出现CPE，则应采用敏感细胞和新的组织样品重新进行上述病毒学检查。6VHSV的鉴定：中和试验
6.1试验准备
6.1.1细胞：把RTG-2(或EPC)细胞培养于96孔微量细胞培养板上。6.1.2病毒：用参考VHSV毒株，传代后制成病毒悬液。6.1.3参考抗血清：抗VHSV的参考血清，使用前于56℃灭活60min。6.1.4待检样品（出现了CPE的细胞培养物）：冻融一次，除去细胞碎片后使用。6.2操作步骤
6.2.1将待检样品用细胞培养液作系列稀释，使其稀释度由10-1到10-8，每管体积为0.5mL6.2.2取两排试管，分别从上述各稀释度的待检样品中取出0.2mL于两排试管中，然后第一排管加入0.2mL抗VHSV参考血清，第二排管加入0.2mL培养液，充分混合均。6.2.325℃温育60min
6.2.4温育后分别将第一排管与第二排管的样品接种于已长满细胞单层的96孔微量细胞培养板，每个稀释度4孔，每孔0.1mL。
6.2.5将抗VHSV参考血清倍比稀释后（1：8至1：64）接种于上述培养板，每个稀释度2孔，每孔0.05mL，作为参考抗血清对照。将参考VHSV接种8孔，每孔0.05mL，作为病毒对照，其余8孔作为正常细胞对照。
6.2.6将VHSV参考病毒按照6.2.1~6.2.3的方法由10-1到10-8稀释，并和参考血清混合反应后加入细胞板，每个稀释度2孔，每孔0.1mL，作为参考病毒十参考血清对照，细胞板中剩余8孔中4孔作正常细胞对照，4孔接参考病毒原液做病毒对照。6.2.7各孔再加人培养液0.1mL。6.2.8放人15℃～18℃培养箱中培养，逐日观察CPE，并按表1填写试验结果。2
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待检样品十参考血清
6.3结果计算
表1中和试验结果记录表
待检样品十细胞培养液
参考病毒十参考血清
GB/T15805.3—2008
参考血清
1：16
1：32
病燕对照
按Reed和Muench法分别计算出“待检样品十参考血清”与“待检样品十培养液”的组织培养半数细胞病变感染剂量（TCIDsc），二者的滴度指数之差的反对数即为中和指数。若正常细胞与参考血清对照为阴性，参考毒对照为阳性，按表2判定结果，表2中和试验结果判定表
中和指数
6.4结果判定
结果判定
阴性(待检查不带毒）
6.4.1若出现临床症状，经细胞培养又出现CPE，并经中和试验为阳性者可判定患有病毒性出血性败血症。
6.4.2若无临床症状，但经细胞培养出现CPE，并经中和试验为阳性者判定为VHSV携带者。6.4.3若中和试验为可疑，需重复一次，仍为可疑者则判定为可疑。6.4.4若仅有临床症状，或仅能在细胞培养中出现CPE，但不能被抗VHSV中和抗体中和者则不能称患有VHS，需进一步作其他病检查。r品化伴网httn：
GB/T15805.3—2008
附录A
（规范性附录）
试剂配制
标准中所有试剂，除特别注明外，全部采用分析纯的试剂。A.1培养液
199培养基，按说明书的要求配制。然后加入10%的胎牛血清，抽滤除菌，一20℃保存。A.2细胞消化液（胰酶-EDTA混合消化液）氯化钠（NaCI)）
氯化钾(KCI)
磷酸二氢钾（KH,PO.）
磷酸氢二钠（NazHPO.）
过滤除菌后分装备用。
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