【国家标准(GB)】 鱼类检疫方法 第4部分：斑点叉尾鮰病毒(CCV)

ICS65.020.30
中华人民共和国国家标准
GB/T15805.4—2008
部分代替GB/T15805.1--1995
鱼类检疫方法
第4部分：斑点叉尾鲷病毒（CCV）Quarantinemethodsoffish-
Part 4:Channel catfish virus(CCV)2008-07-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局数码防伪
中国国家标准化管理委员会
2008-11-01实施
GB/T15805《鱼类检疫方法》分为下列部分：第1部分：传染性胰脏坏死病毒（IPNV)；第2部分：传染性造血器官坏死病毒（IHNV)；第3部分：病毒性出血性败血症病毒（VHSV)；第4部分：斑点叉尾鲫病毒（CCV)；第5部分：鲤春病毒血症病毒(SVCV)；第6部分：杀鲑气单胞菌；
第7部分：脑粘体虫；
本部分为GB/T15805的第4部分。GB/T15805.4—2008
本部分代替GB/T15805.1—1995《淡水鱼类检疫方法第—部分》中的第6章。本部分与GB/T15805.11995的第6章相比主要变化如下：增加了用PCR方法鉴定CCV；
一增加了资料性附录“CCV的PCR产物序列”；结构格式按GB/T1.1--2000的规定，作为部分编写。本部分的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会归口。本部分起草单位：农业部全国水产技术推广总站、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本部分主要起草人：孙喜模、江育林、陈爱平、陈辉、朱泽闻。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T15805.1—1995。
1范围
鱼类检疫方法
第4部分：斑点叉尾颌病毒（CCV）GB/T15805.4—2008
GB/T15805的本部分规定了用中和试验和PCR技术检测斑点叉尾病毒（CCV)的方法。本部分适用于CCV的分离与鉴定，斑点叉尾鳃病毒病的流行病学调查、诊断、监测以及口岸出人境、国内跨区域移动的检疫。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过GB/T15805的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T6682--1992分析实验室用水规格和试验方法（negISO3696：1987）GB/T18088—2000出人境动物检疫采样3试剂和材料
3.1水：GB/T6682—1992，—级。3.2CCV毒株和CCV的D.VA：由农业部指定的动物病原微生物菌（毒）种保藏机构提供。3.3阴性对照：正常细胞组织悬液。3.4CCV参考抗血清。bzxZ.net
3.5Tag酶：—20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.6dNTP(含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmoL/L)。3.7引物：使用时浓度为40μmoL/L。其序列如下：上游引物：5'-TCA-TCC-GAA-TCC-GAC-AAC-TGA-3'；下游引物：5'-CCA-AGA-TCG-CGG-AGA-AAC-3'。扩增目的基因中的136bp片段。
3.8无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。3.9矿物油：要求无DNA酶和RNA酶。3.10DNA分子质量标准（Marker)。4器材和设备
96孔细胞培养板。
4.2微量移液器及吸头。
4.3倒置显微镜。
4.4恒温培养箱。
4.5普通冰箱和低温冰箱。
4.6组织研磨器。
4.7离心机和离心管。
GB/T15805.4—2008
4.8PCR扩增仪。
4.9电泳仪。
4.10紫外观察灯。
4.11剪刀、镊子。
5CCV的分离
5.1采样
按GB/T18088一2000的规定采样。对有临床症状的鱼体长<4cm的鱼苗取整条，若是带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊。体长4cm～6cm的鱼苗取内脏（包括肾）体长大于6cm的鱼则取肝、肾、脾。对无症状的鱼取肝、肾、脾；成熟雌鱼还需取卵巢液。鱼卵则取卵壳。5.2样品处理
应在10℃以下进行。先用组织研磨器将样品匀浆。再用细胞培养液（见第A1章）按1：10的最终稀释度悬浮。在勾浆前未用抗菌素处理过的样品，则须将样品匀浆后再悬浮于含有抗菌素(1000IU/mL的青霉素和000μg/mL的链霉素或其他抗菌素）的细胞培养液中，于15℃下孵育。7000r/min离心15min，收集
2h~4h或4℃下孵有6h24h。
上清液。卵巢液不必匀浆，但须稀释两倍以上。用相同的方去离心卵巢液样品并在以后的步骤中直接用其上清液。5.3病毒分离
对上述1：10的组织匀浆上清液用细胞培养液再作两次10倍稀释，然后将这：10、1：100和
1:1000三种稀释度的上清液，以适当体积分别接种到生长约24h的CCO（斑点叉尾塑卵巢细胞）细胞单层，每孔（2cm2的胞单层最多接种50L稀释液。25
30℃吸附1h后加人细胞培养液。置于25℃~30℃培西
阳性对照组和造测样品都接种细胞后，7d内每天用40倍到100倍倒置显微镜检查，接种了被检物匀浆上清稀释液的细胞培养中是否出现细胞病变（CPE)。空白对照细胞应当正常。
如果阳性对照细胞
出现CPE，而待测￥种的细胞没有CPE出现，则在培养7d后还要用敏感细胞进行再传代培养。传代时，冻融并收集接种组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物。000r/mn，4c离心15min，收
集上清液。接种到新鲜细胞单层，培养7d。每天用40倍到100倍倒置显微镜检查。
种细胞和盲传后均没有P出现，则结果判为阴性如果样品经过接
如有CPE出现，则要用中和试验或PCR方法鉴定是否由CCV引起。
如果在阳性对照组也不理CPE,则试验无效。应采用敏感细胞和一批新的组织样品重新按上述方法进行病毒学检查。
6病毒的鉴定I：中和试验
6.1试验准备
6.1.1CCO细胞培养于96孔微量细胞培养板上，24h内长成单层。6.1.2CCV毒株，传代后制成病毒悬液。6.1.3抗CCV的参考血清，使用前于56℃灭活60min。6.1.4待检样品（出现了CPE的细胞培养物）：冻融一次，除去细胞碎片后使用。6.2操作步骤
6.2.1将待检样品用细胞培养液作系列稀释，使其稀释度由10-1到10-8，每管体积为0.5mL。6.2.2取两排试管，分别从上述各稀释度的待检样品中取出0.2mL于两排试管中，然后第一排管加人0.2mL抗CCV参考血清，第二排管加人0.2mL细胞培养液，充分混合均匀。6.2.325℃温育60min。
温育后分别将第一排管与第二排管的样品接种于已长满细胞单层的96孔微量细胞培养板，每6.2.4
个稀释度4孔，每孔0.1mL。
GB/T15805.4—2008
6.2.5将抗CCV参考血清倍比稀释后（1：8至1：64）接种于上述培养板，每个稀释度2孔，每孔0.05mL，作为参考血清对照。
6.2.6将CCV参考病毒按照6.2.1~6.2.3的方法由10-1到10-8稀释，并和参考血清混合反应后加入细胞板，每个稀释度2孔，每孔0.1mL，作为“参考病毒十参考血清”对照，细胞板中剩余8孔中4孔作正常细胞对照，4孔接参考病毒原液做病毒对照。各孔再加人细胞培养液0.1mL。
放人25℃30℃培养箱中培养逐日观察细胞病理变化，并按表1记录试验结果。表1中和试验结果记录表
待检样品+参考血清
结果计算
待检样品+细胞培养洗
参考病毒十
参考血清
按Reed-Muench
法分别计算出“待检样品十参考血清”以及“待检样品+细胞培养液”的细胞半数S
感染量（TCIDso
标准毒对照为阳
的滴度指数之差的反对数即为中和指数。按表2判定结果。
表2中和试验结果判定表
病毒鉴定Ⅱ：聚合酶链式反应(PCR方法）7.1
样品处理
若正常细胎与参考血清对照为阴性，结果判定
阳性（待检样品不带毒）
将450μL有病变的细胞悬液放人1.5mL的离心管，再加人450μLCTAB溶液（见第A.2章）并混匀。25℃作用2h。
7.2DNA抽提
在含有样品的塑料离心管中加人600μL抽提液2（见第A3章），用力混合至少30s。12000r/min离心5min，小心取上层水相（约800μL）。再加人700μL抽提液1（见第A.4章），用力混合至少30s。12000r/min离心5min，小心取上层水相（约600μL）。再加入一20℃预冷的1.5倍体积的无水乙醇（约900μL），倒置数次混匀后，一20℃8h以上沉淀核酸。12000r/min离心30min，小心弃去上清液。干燥后加10μL水溶解，用作PCR模板。3
GB/T15805.4—2008
依次加人以下试剂：模板10μL，10倍用浓缩的Taq酶缓冲液10μL（见第A.5章），25mmoL/L的氯化镁（MgCl）（见第A.6章）10μL，Taq酶5U，dNTP2μL，引物各2.5μL，加水到总体积为1coμL。
每管加入50μL矿物油。短时间低速离心让矿物油集中在上层。再将反应管置于PCR扩增仪。先94℃4min预变性，再94℃1min-60℃1min→72℃1min，30次循环，然后72℃8min，最后4℃保温。
7.4对照的设立
7.4.1在7.1的样品处理过程中应设立阳性对照、阴性对照和空白对照。7.4.2取含有已知CCV病毒标准株的细胞悬液作为阳性对照。7.4.3取正常的细胞悬液作为阴性对照。7.4.4取等体积的水代替模板作为空白对照。7.5琼脂糖电泳
用TBE电泳缓冲液（见第A.7章）)配制2%的琼脂糖（含1μg/mLEB，见第A.8章）平板。将平板放人水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6μL样品和2μL样品缓冲液（见第A.9章）混勾后加人样品孔。在电泳时设立DNA标准分子质量作对照，推荐使用pUC19DNA/MspI（HpaⅡ）。5V/cm电泳约0.5h，当溴酚蓝到达底部时停止。在紫外灯下观察核酸带并判断结果。7.6结果判定
含有CCV的阳性对照在PCR以后应出现136bp的DNA带。而阴性对照和空白对照不应有这个DNA带。如果待测样品中看不到136bp的带为阴性，能看到136bp的带为阳性。如果阳性对照中什么带都看不到，说明PCR反应没有发生。如果阴性样品中有136bp的带，说明试验中有污染需要重做。如果待测样品产生的DNA带大小异常或者无法准确判定大小，需要重新做并将片段进行基因测序，然后与已知标准基因序列比较(参见附录B)。8综合判定
8.1若出现临床症状，经细胞培养又出现CPE，并经中和试验或者PCR试验为阳性者可判定患有斑点叉尾鲫病毒病。
8.2经细胞培养出现CPE,并经中和试验或者ELISA检测为阳性者，若出现临床症状，可判定患有斑点叉尾鲷病毒病；若无临床症状，判定为CCV携带者。8.3若分离到病毒后，仅中和试验为可疑，PCR试验为阴性，则判定为可疑。附录A
（规范性附录）
试剂配制
标准中所有试剂，除特别注明外，全部采用分析纯的试剂。A.1细胞培养液：
GB/T15805.4—2008
199培养基，按说明书的要求配制。然后加人10%的胎牛血清，抽滤除菌，一20℃保存。A.2CTAB溶液
按CTAB（hexadecyltrimcthyammoniumbromide）2%，氯化钠（NaCI)1.4mol/L，EDTA20mmol/L，Tris-HCl20mmol/LpH=7.5配制。用前加巯基乙醇至终浓度为0.25%。A.3抽提液2
1mol/LTris水溶液饱和的酚：三氯甲烷：异戊醇=25：24：1混合，密闭避光保存。A.4抽提液1
将三氯甲烷：异戊醇按24：1的比例混合，密闭避光保存。A.5Taq酶用10倍浓缩缓冲液
Tris-HCl
氯化钾（KCI)
TritonX-1oo
5commol/L.pH8.8
5commol/L
A.6氯化镁（MgCl2）溶液
浓度为25mmol/L。
A.7TBE电泳缓冲液（5倍浓缩液）Tris
硼酸（HBO3）
1000mL
用5mol/L的盐酸（HCI)调到pH8.0。A.8EB（ethidiumbromide，核酸染色剂）用水配制成10mg/mL的浓缩液。用时每10mL电泳液或琼脂中加1μL。A.9样品缓冲液
每100mL水溶液中含：溴酚蓝0.25g，蔗糖40g。5
GB/T15805.4—2008
附录B
（资料性附录）
CCV的PCR产物序列
TCA-TCC-GAA-TCC-GAC-AAC-TGA-CGC-GTC-GGT-AGC-CCG-ACC-GAT-CCG-TAT-GTT-ACG-GGT-GCG-GGG-GTC-GAC-ACC-GTG-CTC-GCC-GCG-ATG-AGG-CTG-ACC-GCG-GAC-ACG-GGG-GGT-CCC-CCT-CGT-TTC-TCC-GCG-ATC-TTG-G注：涂墨和下划线处是引物序列。GB/T15805.4-2008
中华人民共和国
国家标准
鱼类检疫方法
第4部分：斑点叉尾鲷病毒（CCV）GB/T15805.4—2008
中国标准出版社出版发行
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销
开本880×12301/16
印张0.75
字数13千字
反2008年10月第一次印刷
2008年10月第一版
书号：155066·1-34023定价14.00元如有印装差错
由本社发行中心调换
侵权必究
版权专有
举报电话：(010)68533533
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。