【国家标准(GB)】 鱼类检疫方法 第1部分：传染性胰脏坏死病毒(IPNV)

ICS 65. 020. 30
中华人民共和国国家标准
GB/T15805.1—2008
部分代替GB/T15805.1-1995
鱼类检疫方法
第1部分：传染性胰脏坏死病毒（IPNV）Quarantine methods of fish-
Part 1:Inlectious pancreatic nccrosis virus(IPNV)2008-07-31发布
中华入民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-11-01实施
GB/T15805鱼类检疫方法》分为下列部分：第1部分：传染性胰脏坏死病带（IPNV)；言
第2部分：传染性造血器官坏死病毒（IHNV)：第3部分：病毒性山血性败血症病萨(VHSV)；一第4部分：斑点叉尾卿病毒(CCV)：第5郝分：鲤病蒂血症病毒（SVCV)；第6部分：杀鲑气单胞菌；
一第7部分：脑粘体虫，
本部分为GB/T1580的第1部分
GB/T 15B05.1-—2008
本部分代替GB/T15805.1—1995淡水鱼类检疫为法第一部分》中的第3章。本部分与GB/T15805.1-1995的第3章相比主要变化如下：一增加了用ELISA方法鉴定IPNV；一结构格式按GB/1.12000的规宽,作为部分编写，本部分的附录A为规范性附录。
本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会归口，本部分起草单位：农业部全国水产技术摊广总站、中华人民共和国深划山人境检验检疫局。本部分主要起草人：孙喜模、江育林、陈爱平、陈辉、朱泽闻，本部分所代替标准的历次版本发布情况为：-GB/T15805.1-1995.
1范围
鱼类检疫方法
第1部分：传染性胰脏坏死病毒（IPNV)GB/T15805.1—2008
GB/T15805的本分规定了用中和试验和醛联免疫吸附试验检测传染性胰脏坏死病毒（IPNV）的方法。
本部分用于IPNV的分离与抗原的鉴定，IPN的流行病学调查、诊断、监测以及口岸出人境、国内跨区域秘动的检疫
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过GB/T15805的本部分的引用而成为木部分的条款。：凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用丁本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注口期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法（1eqISO3696：1987)GB/T18088-2000出入境动物检疫采样3试剂和材料
3.1水.GB/T66821992,.二级。
嗨标羊抗免IgG：按说明书使用。3.2
3.3IPNV参考株：由农业部指定的动物病原微生物菌(奔)种保藏机构提供3.4
阴性对照：正常细胞组织总液，IPNV参考抗血清。
单抗IPVV抗体，
硫酸：分析纯。
器材和设备
96孔细胞培养板，
酶标板。
酶标测定仪。
微量移液器。
倒聋显撤镜，
恒培养箱。
普通冰箱和低温球箱。
4.8组织研磨器。
4.9离心机和离心管，
4.10消毒设备。
5IPNV的分离
5.1采样
按GB/T180882000的规定执行。对有临床症状的鱼，体长≤4cm的鱼苗取整条，若是带卵黄1
GB/T15805.1—2008
囊的鱼应去掉卵黄题。体长4r-~6cm的角苗取内脏（包括肾）；体长尺了6cm的鱼则取肝，肾、肿.对无症状的负取肝、肾、脾；成熟雌鱼还需取卵巢液，鱼卵则圾卵壳。5.2样品处理
应在1.0℃以下进行。先用组织研磨器将样品浆，匀浆后，再用含有适量抗菌素（1000IUJ/tuL的青军素和1000g/mL的链霉素或其他抗菌素）的细胞培养液（见第A.1意），按1：10的最悠稀释度悬浮。于15℃下孵育2h~-4h最4℃下孵育6h～21h。7000/min离心15min，收集上清液。卵巢液不必勾浆，稀释两倍以上，用相间的力法离心卵巢液详品并在以后的步骤中直接用其上清液。5. 3分离操作
对上述1：10的纽织句浆上湾液用细胞培养液再做两次10凝释，然后将这1：10.1：100和1：1000三种稀释度的上清液用无菌操作法，以适暂伴积分别按种到长约24h的RTG-2、CHSE或者PC细跑单层中，每孔(2c
细胞培养液。臀18℃
阳性对照组和待测
神的细胞单层最多接种100L稀释液：15℃-20℃吸附1h后，加人
接种细
和足否
勾浆上清稀释液的细脑培
在培养？a后还要用胞进行
胞单层培养物。7
min,4 ℃
10倍~100倍倒置显微意检查。如如有 CP它山现，贝费
中和试验或
果在阳性戏
法进行病毒学术
也未出现C
定知试验
IPNV的鉴定
6.1·试验准备
6. 1, 1把RTG-2
6. 1. 2 病萨:用 IPT
SE.PG 等
梦毒株，
6.1.3抗血清：抗
参考血
6.1.4待检样品（山现高
6.2操作步骤
接种细胞和
00倍倒量显微镜检套，接种了被检物性对照胞没有CPE出现，则
接种了织分上清稀释液的细
新鲜细胞层，养7d。每天用
数有 CPE现，射结果判为阴性。NV引．
和批新的纽织举品章新按上述
反上。
最的培养物）：冻髓次，除去细胞辫片后使用6.2.1将待检样品用细胞最薪列稀释，使其释度由10-1测10-\每管体积为0.5mL。客稀释度的待检样品中取出2mL
6.2.2取两排试管，分别从上邀咨满排试管中，然后第一排管划
0. 2 mL抗IPVV参考血清，第二姚管加人 0. 2 mT.细胞培养激，龙务混合均。6.2.325C温育60min。
6.2.4温育后分别将第一排管与第一排管的样品接种于已长满细胞单层的96孔微量细胞培养板，每个稀释度 4.孔,每孔 0.1 mL。
6.2.5将抗IPNV参考而清倍比稀释后（1：8至1:64)按种于上述席养板，每个稀释度2孔，每孔0.05mL，作为参考抗血清对照。6.2:6将IPNV参考病毒按照6.2.1-~6.2.3的方法由10-1到10-8稀释，并和参考血清混合反应后加入细胞板，每个稀释度2孔，每孔0.1ml.，作为“参考病毒一参考血清”对照，细胞板中利余8孔中4孔作正带细胞对照，4孔接参考病毒原液做病市对照。6.2.7各孔再加入细胞培养液0.1m6.2.B放入20%增养箱中培养，逐日观察病变，按表1填写试验结果。2
10—8
待检样品十参考血清
结果计算
按Reed-Mucn
死量(TCIDsu），
推对照为班
法静别计
商度指数
麗病毒干参
中和指数
IPNV的监定ISA法
包被羊抗Ⅱ
将羊抗 IPV
4 ℃孵育 12 h~24 1
7.2洗涤
将 PBST(见第 A,3
7.3加入待测样品
表1中和试验结果记录表
待检样品十细咆培养液
清能有
中和试验结：
GB/T 15805.1—2008
参考病毒参考血清！
参考血滑
1 : 16bZxz.net
啦对照
病母对照
酵检释离+细胞培养液”的细胞半数三常细胞氧参基血清对照为阴性，标剃按义2判定结果。
牛CPE，
结果鼻定
不带）
阴性(待检有
浓度后包被标板，每孔0.1mL。
到出孔内
满小孔，2nin后倒出，拍干。如此雪爱3次每个样品两孔，每孔0.
另将已知鑫号霉株（阻性耐照）)，正常组织样品（阴性对照)和细胞培养液（空向对照）也各珈两礼3？反应1.5h～2h出孔内液体。用PBST洗3次，方法见7.2,
7.4加入兔抗mNV血清
每孔加0.1mL稀释到工作浓度的免抗IPNV参考血清(用细胞培养液稀释)。37℃反应1.5h~2h。倒出扎内液体。用PBST洗两次，力法见7.，7.5消除非特异性过氧化物酶
每孔加0.1Lu.1%的H2O（用双蒸水稀释）。37℃反应15min以除掉非特异性的过氧化物酶。衡出孔内液体。用PBST洗两次，方法见7.2。7.6加入酶标羊抗免IgG结合物（酶标二抗）每孔加人0.1m.L.稀释到工作浓度的酶标羊抗兔IgG（用细胞培养液稀释）。37℃反应1.5h～2h。倒出孔内液体。用PBST洗3次，方法觅7.2。3
GH/T15805.1-2008
7.7加底物OPD溶液
落液配制见第A.4章。
每孔加人0.1ml.OPD溶液。案温下避光反应显色约10 min。7.8加终扯液
当阳性对照出现明显棕黄色，阴性对照无色时，立即每孔人0.2mL浓度为2mn1/l.硫酸终止反应。
7.9结果计算和判定
当ELISA反应结束并加入终止液后，10min内用酶标仪测量各孔在490nm波长时的光吸收值（A490值）。以室口对照的A49值为零点。先计算阳性对照和阴性对照的A40值之比。阳性对照孔的Atg5值（P)与阴性对照孔的A42值(N)之比人十2.1（即P/N=2.1),表明对照成立。再计算待测样品孔和阴性对照孔的A9值之比。当样品孔的A0值（P）与阴性对照孔的A0值（N)之比人于或等2.1(即P/N≥2.1)时定为IPNV阳性：8综合判定
8.1经细胞培养出现CPE，并经中和试验或者FI.ISA检测为阳性者，者出现临床症状，间判定意有传染性胰坏死病;落无临床症状，判定为 IPNV携带者。8.2仪有临床症状，或仅能在细胞培养中山现CPE，但不能被抗IPNV中和抗体中和或者EI.ISA检测为阴性测不能称有IPN,需进一步作其他病检查。8.3若中和试验为可，则需要重复一次，结果如果仍为可疑则判为可疑，或者收用ELISA方法鉴定。附录A
(规范性附录）
试剂配制
标准中所有试剂，除特别注明外，全部采用分析纯的试剂。A.1细胞培养液
GB/F 15805.1—2008
TC199培养基，按说明书的要求配制，然后加入10%的胎牛血清，抽滤除菌后分装，一20℃保存，A.2包被稀释液（pH9.6)
碳酸钠(NaaCOs）
碳酸氢钠（NaHCOs）
充分搅拌溶解后，4℃保存。
A.3 PBST (pH7.4)
氯化钠(NaC）
氯化钾（KCI)
磷酸兰氨钾(KH2PO,）
上二水磷酸氢二钠(NaHPO·12HaO)水
Twcen-20
播勾后，1C保存。
A.4底物OPI)溶液（pH5.0)
0.1moL/L磷酸氢二钠（NaHPO.）0.1moL/L柠檬校
1 000 mL
1 000 mL
300rL混合成底物稀释液
在100mL底物稀释液中溶入80mg的邻苯二胺（0PD)，然后加人80μL的双氧水（H20z），放5min不变色即m使用(使用前配制）。5
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