【商检行业标准(SN)】 牛奶和奶粉中黄曲霉毒素M1、B1、B2、G1、G2含量的测定

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1664—2005
牛奶和奶粉中黄曲霉毒素
M1、B1、B2、G1、G2 含量的测定Determination of aflatoxin M, ,B,, B, ,Gr,G, contentin milk and milk powder
(IS0) l450l:l998 Milk and milk powder-Determination of aflatoxin M, content-Clean-up by irnmunoaffiniy chromalography undby high-pcrlormancc liquid chromatography,MOD)2005-09-30发布
华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2006-05-01实施
中华人民共和压出人境检验检院行业标滩
牛奶和奶粉中黄曲霉毒素
M:、B,、B2、G、G2 含量的测定SN/T 186:—200s
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街18号
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2006年1月第一版
字数 45 学
2心6个1月第一欧印刷
即数1 2 (000
7号: 155066 -216591
定价14,00元
SN/T 1664—2005
本标雅修收采用IS014501：1净98婉和奶粉一一黄也需毒素M，含量的测定一一延过免疫亲和色谱净化和高效液相色谱测定》(关文版)。本标准根据IS014591:1998重新起草。为：方使比较，在资料性附录A巾列出了本标准条款和国际标准条款的对照览表.
由于本标准对免疫亲和杆的性能进行了测流,将其适月范国进行了扩展，本标准在采用国际标准时逝行了相应的修改。这些技术性差兄用垂白单线标认它们所涉及的条款的贞边空白处，在附录H中给出广技术性差异及其原因的一览表以供参考。为便于使片，本标准还做广下列编辑性修改：a）“本国际标准”一词改为“本标准”；h）而小数点“，”代替作为小数点的过号“，”；卵除国际标准的前言附录和蔡考文献。本标雅的附录、附录T)为规范性附录，降录A、附录,附录F为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管埋委员会提出并H口。本标准由中华人民其和国宁波出人境检验检接局负起草。本标淮王要起草人：李佐卿、康继韬、孙大为、章婷、谢东华、俞雪钩。本标雅系首次发布的出人境检验检疫行业标雅，１范围
牛奶和奶粉中黄曲霉毒素
M、B1B2G1、G2 含量的测定
SN/T1664—2005
本标准舰定了利用免疫亲和柱和高效液柱色谱法测定牛奶、妈粉中黄曲霉毒素M.B1E、G:G含量的方法，
本标滩适用三测定二奶、奶粉中黄曲霉毒素M.、3、3、Gi、G的含量。本标雅同样适用丁低脂和税脂牛奶，低脆利脱脂奶粉。
对奶粉的最低检测限足C.08\g/=，对牛的最低检测娠是0,008[/L2测定方法
2.1原理
试栏通过免疫亲和杜所,觉曲毒素 M1.B、B2、G1、2被提取。特性拆体链合在亲和杜固体支持物：，当椎品通过亲和柱时,抗体选择性池与存在的黄业霉卓素M.B、B、（、（范原)键介·形成范体-抗原复合体，停留在亲和柱上的样的巾干扰基质用水淋洗掉，然后用洗脱液将亲和柱上的董由掌毒素M、B,BG,G，洗脱下米，收集洗脱液。而有荧光检测器的高效浚祖色谱仪(IIPLC)测定洗税液中曲霉毒素 Mi.B、R.、C、Ci含量。2.2试剂和材料
除非特别注明,所同宗剂均为分析绝使用蒸馏水，去离子水或片相站纯度的水。2.2.1免疫亲利柱:免疫亲利柱应该含有董曲霉毒素 M ,B.,B.Gl,G的抗体，亲利柱的最人容量不小于I0ng黄由需毒素M、,B，G-、G,相当于 50T.浓度为2 g/1.的试样）、当标准溶被含Ig黄曲霉每素MB.,BG:Gz（相当于50 mL浓度为&C rg/L的试样)时回收率不低于8C，任何满是这些技术指标的免疫亲和柱均可采用。成该经常检查亲和柱的技术性能，对于每个批次的亲和柱至少检查-次（附录C)。
2.2.2正已烷、
2.2.3三氟乙酸（>99%)。
2.2.4异两醇。
2.2. 5苯.
2.2.6氮气，
2.2.7乙睛:色谱级
2.2.8乙腈+异丙醇十水（8一12十80）.流动析使用前需要脱气混溶）10乙溶液：将0ml.的乙暗（2.2.7)加人90 ml.的求（使而前需要脱）)，2. 2. 9
2.2.13笨十乙清(98十2),用下制黄而毒素13,3Gl、标准溶液。2.2.11米1Z滴（S1).用丁配制黄曲霉声素M.标准济液。2.2.12次氯酸钠溶液（5%）:用于浸泡器M，云除黄向毒素污染。2.2. 13黄曲幕毒素 M.,BBz、G、G标准溶液及标准曲线(见附录 D)。2.3仪器设备
使用实验空通用仪器设备，特殊情说说明始下：SN/T 1664—2035
次性注射器：:0ml.和5℃ml.。
2.3.2真空系统。
2.3.3离心机：能产牛56001/rmin的转速：2. 3. 4移液管:1. 0 rmL.2. rmL 和 50. C nL。2.3.5玻璃烧杯：250ml.
2. 3.6容量瓶; 100 ml.c
2.3.7水济：能在30℃12℃，5c℃2%35℃至37℃之间温度段使用。2.3.8滤纸
2.3.9有刻度的维形玻璃试管些玻璃磨口的瓶颈和瓶塞,容为 5 mL、_0 ml..20 mL。2.3.13高效液相色谱仪
2.3.13.1无脉冲泵：可以询节到依积流量为1ml./mir.。2.3.19.2进样系统：具有固定进样量。2.3.15.3反相色谱柱：填充3uII或者5uII的「八烷基础胶，加填充有反相材料的保护柱：2.3.15.4荧光检测器：激发波长365rrr、发射波长235nrm.2.3.13.5记录仪：带打印机或标绘器，或者电子积分仪、或者算机数据处理系统，2.3.11分光光度计：
2.3.12天
2.4试样制备
2.4.1牛奶
将奶样品在水（2.3.7)中加热到3537。用滤纸（2.3.8)过滤，惑者在6600r/min的条件下离心15 min,至少收集5o rl.的牛奶试样，然后按照2.4.4继续进行分析。2.4.2奶粉
称取10洋品（精确0.1)置于25CImL的烧杯可，将InL已预热50℃的水匀次少量地加人到粉中，月搅拌棒将其混合均勾如果始粉个能究全地熔解，将烧杯在50℃的水浴（2.3.7)中加热3Gmin，什细视匀。将牛奶乳浊液冷却至空温后，用少量的水将其全部转移到100 ml.的容量瓶(2.3.6)中，用水稀释至刻度。用滤纸(2.3.8)过滤，或者在6 scr/nin的条下离心15min。至少收集50nL的牛奶试样，然后按照2.2.4继续进行分析：2.4.3免疫亲和柱的准备
将一次性的 50 m1.注射器筒(2. 3.1)与亲和杜(2.2.1)的顶部相连,再将亲和杜与真空系绕连接起来(2. 3.2)。
2.4.4样品的提取、纯化与衍生
用液管移敢50 I=L的试样（2.4.1或2.4.2）到50=nL的注射管（2.3二），使它们以2=nL/=nir1~=nL/=nin稳定的流逆通过亲和柱，流遂可以通过真空系统辞制（2.3.2）。堰走 50 ml的注射器筒-并用十净的 10 ml 注射器筒机替。然后用10 ml龄水进行清洗-水的流速成该保持稳定。清洗继续抽牢气至亲和杜的下部完全「爆。使亲和柱与真空系统脱离后,将 4 mL 乙(2. 2. 7)加入到 1C mL 的注射器简巾将亲和1柱上的黄由霉毒素 M.,B,B,G,(洗脱下米、所有 4 L乙睛通过亲利柱的吁问至少需要60 ,流速可以过过注射器的杆塞米控制：将洗脱液收集丁锥形试管中（2.3.9）将洗脱液同系列标准曲线工作液一样在氮气流(2.2.6)中挥发近下(如果蒸发至完全下燥，则会造成黄需毒素M,、1-,13.、、G，的损失。)人26μl止已烷(2.2.2)和200μl.一氟乙酸（2.2.3)，在旋涡混约器混约约5s~10，证混合物在40℃水欲（之.3.7)巾放骨19mi然斤在氮气流（2.2.)再挥干，用0,5IIL10为乙晴溶液（2.2.9)溶解，并在旋涡混匀器「充分源勾，供液相色谱用。2
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注：如注人HPC的含有袁曲等志索M.的样品中乙睛含母超过门%，包谱峄变旁。如具水的含母超过%.则对色讲峰的形状设方影响。
2.5高效液相色谱测定
2.5.1测定条件
2.5. 1. 1 泵
以恒定流逸流动相(2.2.8)泄IIPI.C柱。根据需要（根据用色谱柱的型号）：调整FIPIC动相(2.2. 8)中乙晴异内醇的比衡,以保证使黄曲霉毒索 M1,B,2,GI、G与其他成分的分离效果最偿。流动相(2.2.8)的流速根据所用免谱杜（2.3.10.3）的型号不同而有所差异。对丁普通（色谱社(柱长约 25 cm,柱内径约 1. 6 mm)而言,流速在 1 ml/min 左右,效果最好;柱内径约 3 riri 时;蔬速在 ./左有，效果最好。
为了确定最伟的么谱条件，可以元将样品提取液（最好不含有黄曲霉毒索M，B.、BGI)人HPLC,然后再注人提取液与黄曲霉毒素M、E、B、C1、G.标准溶液的混合液。2.5.1.2色谱性能
标准曲线的绒性良和血谱系统的稳定性需要经常检查·多次反复地对固定量的黄曲霉毒素MB、B、G，，G标滩溶滋进样，直至获得稔定的峰面积和峰高，相舒两次峰面积和峰高的差异不得超过5案
英由幕毒素M、13、B，G1G的保留时间与温度有关，所以对测系统的漂移需要补偿。过一段时叫注人固定量的黄曲霉毒素Mi、L,、BG、（2标准溶液，这些标准溶液的测定结果可以根据漂移的情况法行校正。
2.5.2测定
下HPI.C注人适当体积的提取液(2.4.4)应用的色谱条件与进样体积与测定标准线1.作液时一样,这时洗说液中含有的黄毒毒索M_、BI、B2,GI、G将会被分离出来。标准溶凌和样品提取液的进样应该按照楚的顽序进行。
当-系列样品提取液-个接个地被进样时,建议每注人5个样品提取液后注人个黄曲霉毒索MI.E、B.G:G标准溶液：
测定样品提取凌衍尘生物的黄曲霉毒素M.B，B..，G的峰面积或峰高、从标准曲绒「.查出流人的样品提取液中所含有的黄曲霉毒素MI、B、B2、G1、G的质量数（ng）。如样品提取凌衍尘物的黄曲霉毒索M,.B,B，GiG的峰而积或峰高比最人浓度的标准溶液的人或高，用10%乙溶液将样品提取液衍牛物定量稀释.五新注人HPLC分析仪！英由炭毒素 M,B,,B,G1、G衍生物的标准色谱图参见附录 E2.6 结果计算与表述
2.6.1牛奶
2. 6. 1. 1 计算
黄动垂毒素 M 、、1,GI,G2 的含量按(:)式计算:Wu=ma × (V//V) x (:/V)
武中：
黄由掌毒素MI、BI.B.G.G.的含量，单位为微克每升(ug/L)A
根琚栏品洗脱液衙生物的黄由霉毒素的峰面积或峰高，从标准线「育得的黄曲霉毒素的质量数，单位为纳点（ng）。
V——样品洗税液衍三物的最终体积数，单位为微升（uL）：V—一注人样品脱液衔生物的体积数中位为微升L)。V一一通过亲和杜被测样品的体积数.单位为毫(InL)。3
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2.6.1.2测定结果的表示
测定结果以Pg/T.表示,精确到小数点后三位。2.6,2奶粉
2. 6. 2. 1 计算
黄霉素M、13,、B、G、G的含量接（2)式计算：W= mAX(V:/V)IX(1/n)
武中：
W——黄由霉毒素 M.,B.,B2.G,.G的含量，单位为微克得千克(μ/kg）m——59 mL样液(2.4.4)中所含有的奶粉质量数，单位为克(g)。m,V,V 的含义与 2.6. 、]中所定义的一样。注：该公式仅迁用于被测溶液没有释释的情况，如在格释条件下·则应该将稀倍数计逆去2.6.2.2测定结果的表示
测定结果以ug/kg表态，精确到小数点后两位，3测定低限和回收率
3.1测定低限
本方法的测定低限：对妙粉的测定低限足0.08/k名，对牛奶的测定低限C.008/L3.2回收率
3.2.1对三奶添加浓度和回妆率的实验效括如下：·2
在添加浓度为 C.01 μ/L时.曲霉毒素 M.,BB2,Gr、G的尽收率分别为 66.0%、73.2%79.4%、95.3%.87.9%;
在添加浓度为0.05 1g/1. 时，需曲需毒烹 M1、131,13,G1,G的同收率分别为 89.6%、76.2买、80.9%,92. [%、93. 9%;
在添灿浓度为 0.1 g/I.时，黄曲霉毒素 M1、B、R、G:、G的向收率分别为 96. U为,76.7光、81,8%,88. 0%,80.6%.
3.2.2对奶粉添加浓度和回妆率的实验数据妇下：在添加浓度为 C.1g/kg时蕙出声素MBB、G：，G的国收率分别为 73.2%,79.2%80.3%,97.0%,87. 8%;
在添加浓度为C.5g/kg时，黄曲毒素M、B、Bz、G、G的收率分别为86.0%85.2、79.8%,84. 0%,93.8%:
在添加浓度为1.0μg/kg时，英曲炭毒素M-,B，B、GG的回收率分别为89.5%、76.7终、78. 3%,84. 2%,77. 6%。
附录A
(资料性附录）
本标准章条编号与IS14501:1998章条编号对照A.1给出了本标推章条编号与IS0【1591:1S98章条编号对照一览表，表 A.1本标准章条编号与 ISO 145011998章条编号对照本标准章系编寻
2. 2. 2~-2. 2. 5,2. 2. 8.2. 2. 10~ 2. 2. 122.2.13
2. 5. . 1
剂录心
图录 D. 1
附录 D, 2
附录 D. 3
附录 1. 4
対录 A
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对应的IS012501:1998章条编号
warnag
1.1,1.2,1.2
AnncxA
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附录H
“资料性附录】
本标准与 IS( 14501:1998 技术性差异及其原因发B.1给山了本标准与1SO11501：1998的技术性差异及其原四的一览表。表 B. 1 本标准与 IS0 14531:1998 的技术性差异及其原因本标准的章条编号
F. 2. 10 及 2. E. 11
附录 ）
2. 4. 4 皮 T). 4
技术性差葬
将测定萨用于大为节主霉毒素 M B.B.G.Gy.
增加了2, 2, 2,2. 2, 3,2. 2, -,2, 2. 5 而去护了三策中烷。
丝过亨标注验计(其体数推讨参见第3章回收率)该免疫京和样也可以用「吸除和净化1，Bg,Gi,G2
1）山：T标准溶液校准方法及流动相政变，带雾这些剂，
2）三氯卫烷是人（臭氧消挂刻。原方法的泌动乙骑-(25—75)改为乙-垒考AAC公定析方法86，IB.d)及E，开内号-水（S+12+80)
把黄山每毒素的溶剂中一氮;烷设为苯-乙婧。
标准溶液的溶剂及校准方法改变。增加了衔生化步骤。
）增剂了测定低限和F改率，
2）凉来9精密度、10试验报凸去举收变流动相。
M.G标注疮液定，藝号
A0AC971.22A,B,其济剂为苯-乙情。标准溶液白 M艾增划了B1、B、G;、G放参老A0AC971.22A、B对标准溶液选行标定。1) M、B、、G、G. 经衔生后检测灵敏度提高。
2）定容体积更容易准确学挥。
1）根据SN/T00:1—1905的要求增加。2）SN/T0001—1995无要求，
C.I柱效检查
（规范性附录）
柱效检查及回收率检查
SN/T 1664—2005
用移液管(2. 3. 4)移取 1. 0 rrL 的黄曲掌毒素 M1 ,Bi,Bz、G. 、G2 储备液(D. 2)对 20 1mL 的策形试管2.3,9)用恒流的氮气（2,2.6)将液体慢慢次于，然后用10InL1℃%乙腈(2.2.9)溶解干基质.用力摇荡，将该溶液加人到10rL的水中，充分視勾，会部通过免疫亲和栏，按荒明使用亲和杆。渐洗亲柑柱-洗脱下黄声垂寺素 MI,B1,B2、G:G将洗脱液逊行适当稀释后,用 HPLC测定亲和杆键合的黄霉毒素Mi、B、B、GI、G2的含量。计算黄弗套毒素 M.,B1B2、G1,G2 的国收率,将其结果与 2.2. 1 中所要求的指标进行对比。C,2回收率检查
用移液管（2.3.1)移G.8ml.0.095g/ml的黄油需毒素M、13,13%,G、G，标准工作被(D.3)到10 ml的水中，充分泥勾，全部通过免疫亲和杆。按说明使用亲和杜：淋洗亲和杜.洗脱小黄曲霉素MI、B、B、G:G2，将洗脱液进行适当稀释后i,用HPILC测定亲和杜键合的黄曲零毒素MI、B.、B2、G.、G 的含量。计算黄曲莓毒素 M1,BI,B2,G1,G的回收率,将其结果与 2. 2. 1 中斯要求的指标进行对比。
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D.标准溶液的标定
附录1)
（规范性附录）
标准溶液
黄由毒毒索M_、BI、B2.G1,G2标准溶液浓度约为10 μg/1mL。溶液浓度的标定如下：用分光光度计在最人吸收处（接近350I1)测定矮准熔液苯十乙睛（8一2儿对黄册霉寻素M1是苯艺翡（1的吸光值作为背景然后在最大吸收波长处测定黄册霉毒素溶液的A值，接式(L),1)计算黄舞素溶的浓度（（a）：
CAFT=AXMXIO00/BAFT
式中：
A——黄曲霉毒烹标准溶液在最人吸收波长处的吸光值；..( 1
M—摩多质片数值（M：328g/nol、B,：312g/mol、B:31=/mol、G：328g/mol、G330 g/rol):
黄,卅需靠素 3、GG在笨十乙情(98十2)[其巾黄由每寿素M，来用苯+乙情(9十1)的摩尔吸光因子值(M,18 815 m/mol、B, _9 800 /rnal、Bz 20 900 rr\/imol,G17 100 m/ml、G182c0m/mol).
计: 览 A0AC 97-.22 AB -5 版.京. 1390.=315.D.2标准储备液
确定标准溶液的实际浓安值后（.见D.1）.继续用萃十乙睛（9十1)）（2.2.11)将各标准溶液稀释至液度为0.1 g/ml的备液。诺备液应盖好盖，尼铝箔包装好避光保存。将储备液放在冰箱它5以下保存。在这种情况下，储备渡可以稳定2个月。2个月后，应该对储备液的稳定性进行核查。
D).3黄曲霉毒索M.B:、B2、G1、G2标准工作液从冰箱叶取出储备液D.2)放置个室湿，然后移取定量的储备液进行稀释削备成工作液。工作滋宜现虹现用，www.bzxz.net
黄即舞寺素MBB，G标雅T作液配制分别用移液管（2.3.4)各移取1.0ml.的标雅储备液(13. 2)到 20 m1. 的维形试管(2. 3.9)中,用忙流的氮气(2. 2. 6)将体經慢吹1，然斤用 20. 0 ml10%的乙睛（2.2.9)将残留基质重新溶解，间款振摇30min、充分混勾，配成浓度为0.005ug/mL黄由霉毒素 M 、B ,B2.G,.G.标准工作液。在而氧气对诺备液次干的过程中，一定要行细操作，不能让温度降得太低，防止凝骤产兰，D.4黄曲霉毒素 M、B.、B,、Gi,G的标准曲线在做标准曲线时,黄霉毒素 M1、3,B、G1,G,的进栏呆水平分别为0.05ng、0.1ng、C.2 rg 和C.4n根据HPIC进样环的容积量，用标准二作液制成U.5ml.适当浓度的贯由霉毒素MI、B.、B2、G1、G系列标准由线工作液
将系列标准曲线工作液在氮气流中挥发近干，加人20G{L正已烷和200L三氟艺较·在旋涡滤驾器二混勾约5 s~1G s,让视合物在10℃水浴中放置10 min,然后在氮气流用挥一片0.5ml.10%z睛辫液溶解，并在旋涡混匀器上充分混匀，衍生物优液和色谱测定。注：衔生祖程见A0AC082.26E.5版.北京.1990.1311用峰面或峰高对黄曲霉穿离MB,B,GI,G质量数绘制成标准线剂。8
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附录Ｅ
(资料性附录）
黄曲霉毒素的标准色谱图
图E.1黄曲霉毒素M-、B.、B,、Gi、G2衍生物的标准色谱图9
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