【农业行业标准(NY)】 牛胚胎移植技术规程

ICS65.020.30
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1572—2007
牛胚胎移植技术规程
Technology regulations for bovine embryo transfer2007-12-18发布
2008-03-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准附录 A 至 G是资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。前言
本标推起草单位：内蒙古白治区家畜放良工作站NY/T1572—2007
本标准士要起草人：张立、高雪峰、包师格吉勒图、呼格吉勒图、陈国特尔、黄春华、韩锦龙、刘长海、栗军。
1范围
牛胚胎移植技术规程
本标规定了牛胚胎移植技术规程。本标准适用于牛胚胎生产和移植技术操作。2规范性引用安件
NY/T 15722007
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括谢误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标谁。GB/T4143牛冷冻精液
3术语和定义
供体牛domor
指提供胚胎的母牛。
爱体牛 recipient
指接受胚胎的母牛。
牛胚胎移植技术hovine embryo transfer technoloey将良种母牛体内早期胚胎或体外受精及其他方式获得的早期胚胎，移植到同种生理状态相同的受体母年体内，使之继续发育成个体的技术。4供体牛的选择与饲养管理
4.1供体牛的选择
供休牛品种优良、生产性能好。a)
遗传性稳定、谱系清楚、没有流产史、产后90d以上，有两次以上正带发情记录b）
体质健壮、繁殖机能止常，无遗和传染性疾病。年龄在11月龄到10必之间为宜。d）生殖骼高正常，无阴道炎、子宫内膜炎、卵巢垂肿等疾病。4.2供体牛的饲养管理
保持供体牛群饲养环境棚含温度适宜、卫生、干燥：避免应激反应。h）制定合理的供体牛日粮配方。满足供体牛消洁饮水的需要
供休牛超排前8周加强饲养管理。d)
5供体牛的超数排卵及人工授精
5.1超数排卵
5.1.1供体牛的周期发情处理
NY/T 15722007
药品剂量
注射剂量参考附录 A。
同期发情方法
）肌注 PG法：
第-次注射;在任意一天。
第二次注射：在第一次注射后第11d,第二次注射后211~96h时观察发情..b）CDR法：在任·天放人CITDR(含孕激素阴道塞）。5.1.2超数排卵方法
FSH4d注射法：
以母牛发情或放CR之H作为发情周期的0d,在母牛发情周期或放CIDR的第9d-13d中的任一天，每天早晚各注射1次FSH,间隔12h连续4d,递减注射，方法见附录B，5.1.3重复超排
重复超排间隔时间般为45d60d.方法同5.1.2。5.1.4供体牛发情鉴定
在第8次注射FSH之后，对超排供体牛，每隔6h观察次发情情况，每次0.5h以上：以母牛稳定站立接受其他牛爬跨作为发情的准确时间。5.2配种
5.2.1对种公牛的要求
谱系清楚，检疫合格，避传性能稳定，生产性能优良，乳用公牛要经过后商测定。冷冻精液质量符合GB1113的规定：5.2.2配种操作要求
a）母牛外阴部必须经过清洗消毒；b）输精枪必须保持无菌；
c）选择合适的输精枪和输精部位；d）每次输精直线前逊精子不少于3×10\精子数，输精次数不少于2次；e）注意输精时不得触摸卵巢。
5.2.3配种的最适时间
确认发情时12h后逊行第一次人工输精，间隔12h进行第一欧人T输精，每次输精有效精子数不少丁3×10°。
6牛非手术冲胚及胚胎质量鉴定
6.1非手术冲胚
6.1.1非手术冲胚所需主要器材
冲胚管（一路式：经产牛用18=~-20#冲胚管、育成牛用16或18冲胚管）、冲脂管内芯：厂宫颈扩张棒、宫颈黏液吸除器、三通管、硅胶管、二通管、50mL注射器、20mL注射器、10ml注射器、5ml注射器、卵凝斗重100mm培养血（培养Ⅲ外底部划间距为0.5c的横线）±35mm培养、500ml.量筒、高压火菌锅、剪毛剪、镊子，胶布、毛冲和棉球等。6.1.2非手术冲胚所需药品
酒精、酒、新洁尔灭、2%利多卡因、0.9%牛理盐水、青霉素、链霉素及基他抗菌索或预防子宫炭药物等：
6.1.3冲胚液的配制
牡氏磷酸盐缓冲液(PS)，配方见附录C。2
6.1.4非手术冲胚步骤
NY/T 1572—2007
供体牛超排发情后7d士0.5d冲胚，冲胚之前，所用的仪豁、器血等必须经过严格的消毒灭菌处理。冲卵管必须粒查气溅是香漏气。a)
将供休牛保定在六柱栏中，用2%利多卡因在荐雄和第一尾椎结合处或第一尾摊和第二尾结合处实行尾椎硬膜外麻醉，直至尾部无知觉。利多卡因用量每头约5mLb）麻醉后将牛尾固定，清除粪便，用清水冲洗会阴部及外阴，用灭菌卫生纸擦干，酒精球消毒外阴，最后用灭菌的生理盐水棉球擦拭。用扩宫棒扩张子宫颈，然后插人宫颈黏液器将黏腋抽出，随后把带内恶的冲卵管慢慢插人适当部位，当冲卵管达到了广宫角弯曲处，拨出内芯5cm左右，亚把冲卵管往子宫角前端推进。当内芯再次到达于宫角弯曲处时,再向外拔出内芯5 cm~10 crm:直到冲卵管到达子宫角前端为止。d)
冲卵管先冲一定气量，待确定气魏位置后，再究气室所需气最。抽出冲卵管内芯
连接冲胚和一通导管。
用50mL注射器每次吸取?30ml~～40.mL冲卵波：钳住二通导管的输出管，将冲卵液从输入管H
注入子言角，然后销住输人管，使回收液从输出管流到集卵杯（500nL容量）：反复几次，每个子宫角用400mL~500mI.冲卵，
h）把集卵杯内的回收液在温案（18℃～25℃）下，用集卵漏斗过滤，最后保留10mL左右液体，倒人100mm培养匪中，进行镜检。
两侧子宫角冲卵完成后，将气囊空气放出，冲卵管捆至子营体，灌注青雾素、链解素或预防子宫炎的药物。
）肌注前列腺素或类似物。
6.2胚胎的质量鉴定
6.2.1检胚
把感有冲回收液的培养Ⅲ放在体视显微镜\，划分区域检查，避免遗漏，检出胚胎放人盛有保存液的35mm培养血中。
6. 2.2胚胎的发育期鉴定
按附录D做好采胚记录。
超排后的供体牛在发情后第7d土0.5d,此时胚胎处于以下发育期：桑椹胚(M),致密桑椹胚(CM)、早期囊胚(EB)、囊胚(B)、扩张囊胚(EXB)。按际胚胎移植协会规定的数码依次表示为：4,5.6、7 见附录 F,
6.2.3形态学胚胎质量鉴定
用形态学方法进行胚胎质量鉴定，将胚胎依次分为1、2.3、4四级1级：发育正常，胚龄与发育期吻合，卵裂球轮察清楚，透明度适中，细胞密度大，卵裂球均匀。2级：发育阶段基本符合预定胚龄，轮廊清楚，明暗度适中或稍暗或稍浅，细胞密度较小战小型卵裂球过多,有小部分突出的细胞和水泡样的细胞，细胞变性率为10%～20%。3级：轮廓不清楚，色泽过暗或过淡，细胞密度小，窦出细胞占一多半，细胞变性率为30%～40%。4级：变性,退化胚。
7 胚脂的冷冻保存及解冻技术
7.1胚胎的冷冻保存
7.1.1胚胎冷冻保存所需仪器、器材体视显微镜、胚胎冷冻仪、胚胎吸管、细管、装管器、玻璃针、细菌滤器、培养Ⅲ、记号笔：NY/T1572—2007
7.1.2胚胎冷冻保存所需溶液
a）保存液：含有0.4%牛血清白蛋凹（进口)的PBS液。b）10%甘油冷冻液：用保存液配制。c）1.5moL/L乙二醇冷冻液（含0.1moL/L蔗糖）：用保存液配制。7.1.3胚胎冷冻保存操作步骤
胚胎冲洗、装管、记录
a）胚胎1、2级用于冷冻。冷冻前将胚胎在保存液冲洗4次～6次，然后直接放入冷冻液，并将胚胎装入细管。
认真填好所有明细：细管中胚胎的供体牛号、发育期、数量、质量用以下形式表示：如1枚1级桑棋胚表示为IM1。其中M表示发育期，1Mi左侧大1\表示数量，右侧\小1”表示质量：b）将细管放到冷冻仪冷冻。
胚胎冷冻程序
胚胎保存胶洗4次～6次→10%甘油/保存液或1.5moL/l.乙二脖/保存液-平衡15mim~20 rin装管→冷冻仪(—5. 5℃～- 7. 0℃)平衡 5 min植冰+继续-衡 5 min→以0. 3℃/ min～0.6℃/min的速率F降→32℃～—35℃→平衡5min→投入液氮：7.2胚胎的解冻
7.2.1胚胎解冻所需的仪器、器材体视显微镜、温度计、解冻用保温杯、0.25miL.塑料细臂、吸卵管、细管推杆、装笋器、重90mm塑料培养血、0.22um针头式细菌滤器。7.2.2胚胎解冻所需溶液
保存液：含0.1%牛血清自蛋白(进I)的PBS液。解冻液：1moL/L蔗糖/保存液。
7.2.3胚胎解冻方法
10%甘油/保存液冷冻胚胎的解冻：装胚细管→空气浴（18℃～25℃)105-32℃水浴10s→擦十细管→剪去细管塞-推出胚胎→解冻液1min-保存液，冲洗5次~～6次→镜检→装管。1.5moL/I.艺二醇/保存液（含0.1moI/IL.熊糖）冷冻胚胎的解冻(一步细管法）：装胚细管→空气浴(18℃~25℃)10s32℃水浴10s→擦T细管→剪去细管塞→把细管装人移植枪-→移植（那胎解冻后5min内移人受体）。8受体的选择及饲养管理
8.1受体的选择
&）有正常的发情周期，无繁殖机能疾病，经检疫无传染疾病，健康、营养状况良好。b）年龄在18月龄至6周岁，经产/分娩在90d以上，产犊性能和哺乳能力良好，无流产史。e）配种两个情期以上的难孕母牛不能作为受体。8.2受体饲养管理
a）受体牛在移植前8周开始补饲，加强养管理。b）受体牛在移植前5周，注射维生素A、维生素D维牛紊E针剂，补充微量元素，如硒、锌等。受体牛单独组群、编号、饲养，保环境相对稳定，避免应激反应。9牛胚胎非手术移植
9.1体的同期发情处理
9.1.1同期发情处理方法
同期处理之前受体牛进行直肠触摸，检查卵巢是否有周期性黄体肌注 PG法
第一次注射：在任意一天。
第二次注射：在第一次注射后第11d,第二次注射后24h～96h时观察发情。CIDR法
NY/T 1572—2007
在任意一天放人 CIDR。放CIDR 日定为0d,在第7 d~9d注射PG,第 9d11 d取出 CIDR,观察发情。
9.2受体牛的发情鉴定
应对受体牛跟群观察，以受体牛稳定站立接受其他牛爬跨为发倩。准确记录。9.3受体牛的胚胎移植
9.3.1移植所需器械、药品
移植枪、塑料硬外套管、隔离无菌外、碘梯球、剪毛剪，2%利多卡网、70%酒精棉球、5mL一次性注射器、无菌纸、生理盐水棉球。9.3.2受体牛移植操作步骤
受体牛在发情后6d~8d均可进行移精（发情之时定为0d)。移植前对受体牛进行直肠检查，a)
检查黄体，有发育黄体的母牛用于移植。受体牛实行12尾椎间硬膜外麻降，洗消毒外阴部。b
对照供体牛采胚记录表和合格受休牛的发情记录，受体牛胚胎胚龄相吻合。d)
解冻胚胎
重新将胚胎装人0.25ml.塑料细管(-一步细管法不需要重新装管）。细管装入移植抢。注意移植枪的前端保持无菌。把装有细管的移植枪套上移植硬外套，再查上无菌隔离外套：将胚胎移楠到受体牛有黄体侧宫角。h
按附录G做好受体牛移植记录。
9.3.3胚胎发育期与受体移植时间的对应关系胚胎发育期与受体移植时间的对应关系见附录F。10妊娠的牛饲养管理
在移植后60)d～90d对受体牛进行妊娠检查，对已妊娠的受体要加强饲养管理，避免应激反应。妊娠受体牛在产前3个月要补充足量的维生素，微量元索，适当限制能量摄入，保证胎儿的止常发育,避免难产
NY/T 1572--2007
A.1用于超数排卵的激素
附录A
(资料性附录）
前期准备激素剂显
FSHc促滤泡素）.国产FSH，10mg/瓶：②进口FSH,400mg/20ml/瓶，前列腺素（PG）：①国产前列腺素，0.2mg/2ml/瓶。②进口PG，5mg/20ml/瓶。CIDR：含有孕激森阴道。
A.2激素剂量【注射总量/头
FSH剂量(肌注)现表A1。
表 A.1FSH 推荐剂量
经产牛
育成牛
9 mg~-11 mg(中国科学院制剂)
300ing-~400mg(加率大制剂）
8tg~12mg（中国科学皖制剂）
200 mg~300 mg(加卓大制剂)
注：PG剂量；各品种的经产牛及育成牛肌注国产PG0.6 ing或进FG3. 0 ml。6
8 lg~9mg(中国科学院制剂)
950mg-~350mg(加拿大制剂）
6 mg-~8 mg(中国科学院制剂)
200mg~250mg（加伞大制剂）
发情调期天激
附录B
【资料性附录
FSH 4d 注射法
0.6 mL PG
注：(1)木表以FSFI总剂盘368mg为例：(2.8+2.3+2.3+1.8)×2×20-368mg：(2)FSH为进口（每瓶400mg)用20 ml.牛理盐水郁释；（3)第5针让射FSH1时，同时肌注鼠产氯前列腺烯醇0.6mg或进口PG3. 0mLI(4)AI表示人T授精
NY/T 1572—2007
NY/T 15722007
附录C
【资料性附录】
杜氏磷酸盐缓冲液(PBS）配方
NaHIO,(Na1F0,12IIO)
CaCl(CaCle 2H,0)
MgCE(MgCl · 6Hao)
丙酮酸钠
葡葡糖（葡糖·sO)
背得素
链爵素
配制说朗：
配制PBS的所有成分必须是分析纯以工的化学制剂。配制PBS所用水是电阻值超过18MQ的超纯水S/L
1.5(2.916)
0. 10 (. 132)
0.10(0.2133)
1.00 (1,10)
可以用进口PBS粉剂，直接用超纯水配制，详见产品使用说期。配好的冲卵液需过滤灭菌、低温保存（4℃～5℃），pH为7.2~-7.6，渗透压为270mOs~290 mOs:
腋氮罐
激紫处理；发情日
FSHI品牌（厂家）
采压：
染樵胚
未受猜卵
冷冻液：10%甘油
提瀛号
注册号
社册号
附黎D
（资料性附录】
供体牛采胚记录表
国产/进口
精液缩号
冷袜日期
小简翁号：
1.5moL/L乙二（直接秘植）
预计发情目
实际发情日
人工授精日
第二次
技术员
细性导和颜色：
冲胚时间
孕酮处理
胚胎数和质量
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解冻日期
NY/T1572-2007
2. 8-cell
7.Expanded blastecyst
8 d-9
附录E
(资料性附录）
孕期胚胎的发育形态模式图
2. 16-cell
5.Patly blastacyst
8. Hlatched blaslocyst
1、未卵或1-细贮压胚哈，为「日龄环胎3.早期睾。为 1~-5 H龄肽脂
5,早期囊胚，火 5. 5--6. 0 口龄胚哈7 扩张囊既胚、 为 6. 5--7. 5 日龄肝胚胎9扩张的游化癌胚，为9.0～小3,0日擀豚2. 4-cell
3. Early morula
6. Blastocyst
T tl-8 d
9. rxpanding hatched blastocyst0d下载标准就来标准下载网
2. 2-16-细胞压胎 为 2--4 日龄胚胎4. 紧缩案椹那，为 5. 5~6. 0 日龄胚胎6 数还，为 6. (~~6. 5 H龄联胎8.孵化凝压，为7. 5~8. 0甘龄脏胎图E.1.早期胚胎的发育形态模式图10
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