【农业行业标准(NY)】 羊胚胎移植技术规程

ICS65.020.30
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1571--2007
羊胚胎移植技术规程
Technology regulations for sheep( goat)embryo transfer2007-12-18发布
2008-03-01实施
中华民共和国农业部发布
本标推附 A至F为资料性附录
本标准由中华人民共和国农业部提出。前言
本标准起草单位：内蒙古户洽区家畜改良工作站。NY/T1571--2007
本标准主要起草人：张氵高雪峰、包呼格吉勒图、陈巴特尔、呼格吉恸图、黄春华、韩锦龙、哈申高娃、栗军、刘长海。
1范围
羊胚胎移植技术规程，
本标摊规定了羊胚胎移植技术规程：本标适用丁羊胚胎生产和移植技术操作。2术语和定义
供体单donor
指提供胚胎的母羊。
受体羊 recipient
指接受胚胎的母羊。
羊胚胎移植技术ovineembryo transfertechnelogNY/T 1571—2007
将良种母羊体内早期胚胎或体外受精及其他方式获得的早期胚胎，移植到同种生理状态相同的受体母羊体内，使之继续发育成个体的技术。3供体羊的选择与饲养管理
3.1供体羊的选择
a）供体羊品种优良、生产性能好、经济价值高。b）遗传性能稳定、谱系清楚。
）体质健壮、殖机能正常、尤遗传病、生殖辉病和传染性疾病。年龄在 1--5 胤岁：d）产历清楚:性周期止常
e）产羔90d以上.经观察率少有2个以上正常发情周期的母羊3.2供体羊的词养管理
3.2.1饲养环境
保持养环境温度稳定、适宜、卫生、干燥、避免应激反应。3.2.2饲喂方式
制定合理的供体羊日粮配方，保证营养平衡，满足清洁饮水，适当的运动。4供体单的超数排卵及人工授精
4.1超数排卵
4.1.1超数排卵的季节和发情周期绵单和山羊最适超排季节为9月上包至12月下仙。绵羊的发情周期在15d-~17.5d，山羊在19d--22d。供体母羊在越排前期需要观察2个完整的发情周期.4.1.2用于超数排卵的激素选择
a）国产激素类：FSTI（促卵泡素）、LH(垂体促黄体生成素）PG（前列腺素）、CIDR（含孕激素阴道栓塞）。
NY/T1571-2007
b）进口激素类：可使用国外生产的同类优质产品。4.1.3激素剂量（注射总量/只)
FSHI(国产)剂量。
编羊：90 U~-200 U
羊:90 U--160 U。
LH国产）剂最：根据FSH的注射剂量·肌注80~120U。PG剂量各品种的缔羊和山羊肌注0.08mg/次~.1mg/次。注：进1药品态照其产品说明书确定剂量。4.1.4超数排卵方法
4.1.4.1自然发情或PG同期法
绵羊以母羊发情之口作为发情周期的0d.在母羊发情周期的13或3.5cc周期在17.5的羊在第13.5d)开始，每天早晚齐注射1次FSH，中间间隔时间12h，连续3d，避减注射。山羊以母羊发情之日作为发情周期的0d，在母羊发情剧期的15d开始，每天早和晚各注射的1次FSII.中间间隔时间12h.连续3cl,递减注射，注射方法见阴录A。4.1.4.2孕激素法
绵羊的放入CIDR之日作为0d，在放入CIDR的913d开始超排.注射方法见附录A，在第S针注射FSH时取出CIDR，
山羊以放人每一个CIDR之口为0d在放人CIDR的第13d更换第二个CIDR，在放入第一个CIDR的第15d开始超排，注射方法见附录A，在第6饣注射FSH时取出CIR。4.1.5供体羊发情鉴定
在第6次注射FSH吋即对超非供体羊观察发情。观察时间：尽晚各1次，每次不少于0.5h。观察方汰：试情公羊系好试情布，放人母羊样中试情，每30只~40只供体羊放1只试情公羊，以母羊站立接受试情公羊爬跨作为发情的标准，并记录好发情的准确时间4.2配种
4.2.1对种公羊的选择
谱系健金，检疫合格，遗传性能稳定，牛产性能优良，精液品质良好：4.2.2采猜、输精
2）采精前对种公羊外牛殖器清洗消毒。采精、精液稀释、输精用的器具严格火菌、消毒。）母羊外部必须经过清洗消毒，℃）稀释后的精液温度要保持在25\℃C左右。d）用开睦器打开阴道找到子宫颈外口，将输精器插入子宫颈外口不少于1cm，注人定量精液。4.2.3配种的最适时间
确认发情时即进行第次输精，之后每隔12五输精1次：鲜精液活力在70%以上，每次输精有效精子数不少于3×10°，输精次数3次4次。5羊手术冲胚及胚胎质量监定
5.1手术冲胚
5.1.1冲胚主要器材
丁未台、剃毛刀、创布、止血纱布、剪毛剪手术刀柄、手术剪、止血钳巾帕钳、持针器、肠钳（带乳胶管）于术刀片、缝合针、镊子、$120mm表面血、Φ180mm衣面血、6%~8头皮针（尖端磨纯）、18-20针头（尖端蘑钝）、l0mm透明硅胶管、10ml.注射器、20mL注射器，8mm玻离管和35mm培养M等
5. 1. 2冲胚所需药品
NY/ T 1571--2007
酒精、碘、新洁尔灭、0.9%生理盐水、青霖素、全麻药和解麻约（山羊麻醉用）等。5. 1. 3冲压液的配置
杜戊磷酸盐缓冲液(PRS)配方见附录B。5.1.4供体羊手术冲胚步骤
按附录（做好采胚记录。
5.1.4.1供体羊手术
手术部位在离乳房前端约2cm处，腹中线的两侧均可。a)手术前空腹 24 h～36 h.适量饮水,麻酵及保定：麻醉剂量视绵、山羊体重面定，将母平侧卧或仰卧保定。by
剪去手术部位的毛，剪毛范围约20 cm×20cm。用肥皂水清洗于术部位，同时用剃毛力剃净毛茬，再用水洗净。
用0.1%的新洁尔灭消毒手术部位：用2%~2%碘酒消毒。
用70%酒精棉球对于术的部位脱碘、晾工。盖于术创布，,孖固定。
避开血管，用手术刀将于术部位纵向切π3cm～5cm长的刀口，将皮下结缔组织分离暴露肌膜。
i）用于术刀将肌膜轻轻切开，暴露肌肉层，再用刀柄后端将肌肉层和腹膜钝性分开。）在骨盆腔，耻骨前沿触膜了宫角，并将子宫、卵巢引出刃口外，记录两侧卵第黄体和翊泡数。5.1.4.2输卵管冲胚
在超排羊发情后 66 h~72 h 从输卵管采集 2~8 细胞胚胎:方法：用6*～8+头皮针从宫管还接部的了宫端导入到输卵管峡部.将冲卵管从输卵管喇叭口插人2cml无右，冲卵誉远端与120cm表面血相接，手先用10mL注射器抽取5~8mI冲卵液，与头皮针连接，把冲卵液缓缓推出，胚胎即通过母羊输卵管回收到表面皿中。另一侧输卵管操作同上。5.1.4.3子营冲胚
在超排丹羊发情后5.5d~7.0d，从子宫采集桑椹胚举扩张囊肝，脉胎可用于移植、冷冻、分割及其他研究。
方法：用18=～20)#针头在子宫角基部孔小礼，然后将8+10#冲卵管从此孔导人子宫角大弯处，给冲卵管气骤，充气（充气量2ml~5.mL)，拔出冲卵管内芯，在宫管连接部用6~8*针头扎人子宫角，用20ml注射器与针头连接，把冲胚液注人子宫腔。用重180mm表面Ⅲ接收冲胚液。另一侧子宫角冲胚方法同上。每侧子富角需40mI.冲胚液。可根掘实际需要选择输卵管冲胚法或子宫胚法。冲胚完毕后，用25%～30℃的牛理盐水将子宫及卵巢洗干净供体母羊创1采用两层缝合法。即腹膜与肌肉进行缝合：皮肤进行节结缝合：针间距1crn。在肌肉与皮肤闻撒适盘青霉素粉：以防创口感染。5.2胚胎发育期鉴定
5.2.1检胚
盛有冲胚回收液的表面血放在体视显微镜下，在18℃～25℃内镜检，将检出的胚始放入盛有保存的Φ35mm培养血中。
5.2.2胚胎形态学鉴定方法
a）输刚管胚：胚胎处↓28细胞发育期：卵裂球轮廊清楚，球体饱满，明暗度适中，数日吻合，为3
NY/ T 1571 :2007
可用胚。
b）厂宫胚胎：处」3~7发育期的肚胎质量鉴定：分为1、2、H、1级。1级：发脊止常，胚龄与发育期相吻合，卵裂球轮廓清楚，明暗度适中，细跑密大，删裂均匀。细胞变性率不超过10%，见附录C。
2级：胚龄与发育期成本吻合，轮廊清楚，明培适中或硝暗或稍谈，细胞密度较小或小型形球过多，细胞变性率为10%20%。
3级：轮不清楚，色洋过暗或过淡，细胞密度小，细胞变性率为30%~-40%4级：退化胚、变性胚。
6胚胎的冷冻保存及解冻
6. 1胚胎的冷冻保存
6.1. 1胚胎冷冻保存所需仪器、器材体视显微链、胚胎冷冻仪.吸胚管、细管、细管塞、装管器、细菌过滤器、培养血。6.1.2.胚胎冷冻保存所需溶液
保存液：含有0. 4%牛血清白凹或20%血清的PBS液。10%书油冷冻液：用保存浓配制。1.5moL/L.乙三醇冷冻液（含0.1moL/L蔗糖）：用保疗液配制。6.1.3胚胎冷冻保存操作步骤
6.1.3.1胚胎装管及记录
1、2级胚胎用1冷冻，冷冻前将肽胎在保存液中冲洗4.次～6次，然后直接放人冷冻液，并将胚胎装人细管。
认真填好附录T)所有明细；细管中胚胎的发育期、数量、质量用以下形式表示：如1枚1级桑椹胚表示为1M1：其中M表示发育期，IM左侧\大1\表示数量，右侧\小1”表示质量。6.1.3.2胚胎冷冻程序
胚胎-保存液洗 4 次~6 次→10%甘油/保存液或 1. 5 mol,/ [. 乙 一醇/存液 -平衡 15 1min～20Inin装管→冷冻仪（—5.5℃7.0°)-→平衡5min-植冰→继续平衡5min→以0.8℃/min~-0.6℃/min的速率下降→—32℃～-35℃→平衡5min→投人液氮。6.2胚胎的解冻
6.2.1胚胎解冻所需的仪器.器材体视显微镜、温度计,解冻用保温杯,0. 25 ml. 塑料细管、吸卵管、细管推打,装管器,90 mm 料培养血、0. 22 μm 针头式细菌滤器等。6.2.2胚胎解冻所需溶液
保存液：含0.4%牛血清自蛋自或20%血清的PBS液。解冻液：l moL/L蔗糖保存液。
6.2.3胚胎解冻方法
）10%甘油冷冻胚胎的解冻：
装胚细管→空气浴(18℃～25℃）1032°水浴10s指干细管剪去细管塞*推山胚胎→解冻液1min-保存液冲洗5次~次—镜捡。b）1.5moL/L乙二停/保存液（含0.1mol./I.薰糖）冷冻胚胎的解冻（一步细管法）：装胚细管空气浴（18℃~25%)10s→32%水10s措干细管→剪去细管塞镜检。7受体羊的选择及饲养管理
7.1受体羊的选择
NY/ T 157.---2007
繁殖性能良好，发情周期正常，死繁殖机能疾病，经检疫无传架疾病，营养状况良好，b）年龄在1～4周岁母羊。
）产羔90d以上，发情止常。
7.2受体羊的伺养管理
受体羊在移植前8周开始加强饲养管理。b）受休羊单独组群、编号，保持坏境相对稳定，避免应激反应。8绵羊、山羊胚胎手术移植
8.1受体羊的同期发情处理
8.1.1同期发情处理方法：
药品：前列腺素(PG)、CIDR。
PG法：
第-次注射：任意一天肌注PG0.1mg/只。第一次注射：绵羊在第一次注射后7d，山羊在第-次注射后9d～10.d，注射剂量同第一次：第二次注射后12h~72h观察发情。
CILDR法：以放人CIDR之H为 0 d,绵羊9 cl,山羊 12 d 后取出 CIDR,并在敢出的前 96h肌注PGo.1mg/只，取出CIER后，12h～72h，观察发情。8.1.2胚胎发育期与受体移植时间的对应关系胚胎发育期与受体移植时间的对应关系见附录E。8.2受体绵羊、山羊的胚胎移植
8.2.1受体移植所需器械、药品
手术台、剃毛刀、剪毛剪、手术刀柄、止血钳、中帕钳、持针器、于术刀片、缝合针、缝合线、创布、纱布、16*针头(尖端磨钝）、35mm培养血、移植器、针头式细菌滤器,5mL一次性注射器、洒精、碘、新清尔灭、生理盐水和青素等。
8.2.2受体绵羊、山羊胚胎移植操作步社）手术过程同供体母羊的冲胚手术。b)
吸取胚胎:用移植器先吸…段约0.5cm长的保存液，吸一段约0.3cm的空气然后吸取含胚胎的保存液0. 5 cim,吸0. 2 cm空气然后再吸取 0. 3 cm保存液，输卵管内移植：将有黄体的翰卵管伞部拔开，找到管口，把装有胚胎的移植器从管口插人2~3 cm，然后将胚胎轻轻推出即可。d）子官内移植：将有蕙体侧的了宫角取山，用尖端磨钝的16\针头在子宫壁上扎一小孔，把装有胚胎的移植器从此孔插人子宫腔内，伸垒子宫痛尖端斥将胚瞻轻轻推出即可。按附录E做好受体移植记录。
受休创口缝个步骤同供体创口缝台，NY/ T 1571—2007
配科固究
附录A
资料性附录】
绵羊(山羊)FSH 3d注射法
FSJI-E
汪：括号中的数字为山羊FSI注射周期天数。《1)AI表示人工授，
(2)F:H(1(0 U安甄)和T.H(200 U/瓶)用生理盐水稀释，(3)在第 5,6 次射 FSH,间吋肌肉注射 PG.15
FSH20+PG
FSH20+PG
FSHI8+PG
15118·IG
HSHES--HG
FSI15PG
FSH14+PC
ISII14IPC
SH2---PG
FSH12+PC:
FSHIOPG
FSH 0-PG
发情AT
LII:120 U
发情 AT
发情 AI
1.H.110 1.
发情AI
发情A!
LH:110 L7
发情AT
发情AI
1H:119U
发情AI
发清 Al
IH,JOO T
发情A
发情A
LH:110 U
发情AI
发情Al
发情A1
发情 AI
发情AI
发情AI
发情AI
发情AI
发情 AI
发情 A
发情 AI
发情AI
发情AI
（4)确定超排处理羊发情后立即注射T.TI同时配种，妇巢FSH来注射完供体羊已发情，停止江射FSH，立御汁射T.HG
NaHP,NaIIO4 12H.O)
GaClMgCl (MgCk · 6IO)
丙酮酸钠
葡萄糖(葡樹·H,(0)
青霉索
配制说明：
（资料性附录】
杜氏磷酸盐缓冲液(PBS)配方
1. 5(2.916)
心.10(0.132)
0.10(0.2133)
1.00(1.10)
.0.C75
NY/ T 1571—2007
配制PBS的所用药品必须是分析纯以上的化学试剂。也可以使用进口成品PBS粉剂，详见产1
品使用说明书。
配制PBS所用水是阻值超过 18 M2的超纯水。3）
配好的冲卵液需灭菌pH为7.2~~7.6,渗透压为270 rm0)s~～~290 m(0s,温保存(1℃～5℃)NY/T1571—2007
2.8细胞
2.5 l~3.0 cl
4.紧缩荣棋胚
5.5 d-6.0 d
7.扩张粪胞
6.0 d-7.od
附录（
(资料性附录）
早期胚胎的发育形态模式图
2.16细炮
3.0 d4.0 d
5.-期囊胚
5.5 d~6.0
7.5 d-8.0 d
1. 未受稍卵或 1 -细胞环胎,为 1 H龄脉胎2. 2-16 -胞胚胎,为 2~2 门胚胎3. 早期桑-为 4-5 μ龄压胎
1. 紧缩案科还,为 5. 5~56. 5 片激脂和5. 早期棘胍,为 5. 5~-. 日龄还胎6. 避胚,为 E. 0--6. 5 几龄胚7. 扩遗既,为 6. 5- -7. 5 口龄渐胎8、期化率压,为 7. 5-~5. 0 H龄肠胎印。扩的游化效医,为9,0~-10,C口龄还胎图C.1早期胚胎的发育形态模式图2.4胞
20 月~2.5
3.早期棋压
6.0 d~6.5 d
9.扩兆的孵化整
9.0 d10.0d
液氮罐
薇素处理：发情目
FSH品牌（厂家）
梁胚：
藥樾胚
未受精卵
冷冻滋：10%甘油
提漏号
注册号
附录D
[资料性谢显]
供体羊采样记录
国产/进口
精编号
冷冻日期
预计发情口
实际发清H
王授精
第一次
第二次
第三次
技术员
细管号和
小简缔-号
1.5mo./T.乙一醇（直接移值）
胚胎数
和质量
NY/ T 157 {--2007
洲胚时间
争处理
解弥日期
NY/ T 1571—2007
胚胎发育期
桑棋胚(M）
早期囊胚(EB)
發胚(B)
扩张囊胚（EXB)
附录F
【资料性附】
胚胎发育期与受体移植时间的对应关系受体移植时间（发情之时为0l)免费标准下载网bzxz
$.5 d±0.5 d
6.0±0.5d
6. 5 d±0. 5 d
7. 5 d±0. 5 d
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。