【商检行业标准(SN)】 进出口水产品中亚甲基蓝残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法和高效液相色谱法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1974-2007
进出口水产品中亚甲基蓝残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法和高效液相色谱法Determination of methylene blue residues inaquatic product for import and export-LC-MS/MS and HPLC method
2007-08-06发布
中华人民共和国
数码伪
国同家质量监督检验检疫总局
2008-03-01实施
本标罹的附录A、附录B、附录C均为资料性附录。本标推由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。$N/T1974—2007
本标推起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验捡疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局，中华人民共和国土海出人境检验检疫局。本标谁主要起草人吴斌,徐锦忠、陈惠兰、杨方、丁祷、林宏、郭德华、黄娟。本标准系首改发布的出入境检验检疫行业标准。范围
进出口水产品中亚甲基蓝残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法和高效液相色谱法SN/T 1974—2007
本标推规定了水产品中亚甲基蓝残留最测定的没相色谱-质谱/质谱和高效液相色谱检测方法。本标推适用于鱼、虾及其制品中亚甲基监残阐的测定和确证。2 规范性引用文件
下列文件中的条欲过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用义件，其随后所有的修改单（不也括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡足不注日期的引用义件，共最新版本适用于本标准，GB/T6682分析实验室用水格和成验方法3试样制备和保存
3.1试样制备
鳗鱼取连皮的血肉，将皮、肉分离后取鱼皮置于微波炉中加热30s后连同鱼肉，虾、鳗鱼制品取所有可食部分一并放人高速组织捣碎机均质，充分混匀，装人清洁容器内，并标明标记。制样操作过程[必须防山样品受到污染或发生残留物含量的变化。3.2试样保存
试样于—18℃以下保存
第一法液相色谱-质谱/质谱法
4方法提要
试样中的残留物用乙脂-乙酸钠缨冲溶液提取，液液分配到一系甲烷层，4性氧化铅和阳离子固相举取小柱净化，用申联质谱在电喷雾-选择反应监测离了的模式下，进行质谱定量和确证，外标法定量。5试剂和材料
除非另有说明、所用试剂均为分析纯,水为G:R/T 6682规定的一级水。5.1甲酸:HPLC级。
5.2中醇:HPT.C纹.
5.3乙晴。
5.4二氯甲烧。
5.5性氧化铝:80 日～120 日。
5.6 10%甲龄甲醇溶:量取 10 mT 甲酸加I人 90 mL 甲醇巾混勾。5.720%甘醇水溶液：量取200 IL二H醇加人 800 rml.水中混勾，5.8乙酸钠缓冲溶液(0.1mo1/L，pII=4.5）：称取8.2号无水乙酸钠溶解于1000mL水中，冰艺酸调μH 到 4. 5。
SN/T 1974—2007
5.9对甲莱磺酸溶波(1.0101/1.)：称取17.2多一水对甲苯磺酸，并用水稀释牟10mL。5. 1030%甲醇溶液:量取 30 mL甲醇加人 70 rnl.水中混勾。5.11阳离了交换苯取小柱：WCX，60mg/3mL或捐当者。5.12中性氧化铅萃取小杜：LC-alumina-N，E00mg/3mL或相当者。5.13滤膜：0.45 m，有机相，
5.14亚中基蓝（CAS号：7220-79-3.分子式：CHi，CIN.S)标准品.纯度大于等于96%。5.15标准贮备液：准确称取适品的亚甲基蓝，用30%中醇溶液（5.10)分别配制成100Pg/1nL的标准贮备液，再用该中醇溶液（5.10)稀释配制1.0μg/ml.的标准溶液，2℃～8℃避光保存。5.16标准工作溶液：用1g/ml.的标准游液，用30%甲醇溶液（5.10)分别稀释成200.0g/mL，100.0ng/ml..50.0ng/mL，20.0ng/ml，10.0ng/ml.五个浓度，现用现配。6仪器和设备
6.1液相色谱-质谱/质谱联用仪，配有电喷雾(ES1)源。6.2 离心机:4 000 1/inin
6.3涡旋混合器。
6.4 尤油真空泵。
6.5璇转蒸发仪。
6. 6固相萃取装置。
6.7高速均质器。
6.8氮气吹「仪，
测定步骤
7.1提取
称取5g均匀样品（精碎到.免费标准bzxz.net
离心管中，培人
5β中性氧化铅,依改加人1. 0mL对中苯磺酸<5.0)溶液，t.0mL乙酸钠缓冲腹(5.8），施30s.加人8mL乙腈，100001/min均质2 min,离心5 min(2000 r/mi,将上满液转多到50mt-离心管中4. 0 mL乙睛重复提收残避一次，合并上清液。于离心管中加人8my/兰计醇溶液<5.7>，ml.手氟中烷，涡旋1in，离心5min（2000r/min），收集下层有机层宇浓缩瓶中在40℃减压旋转蒸发至-F。7.2净化
将中性氧化铝柱中接在改CX社E芳，而3mL乙脏活化中性氧化铝小杜和WCX萃取小柱。用6mL乙睛分三次（每次2mL)滤旋振菌溶解上步提取液爽留物.并依次过柱，控制WCX柱上样流速约为1.0mL/mil,再用2ml.乙晴淋选小性氧化柱后.弃去中性氧化铝柱，依次用3mL水,3mL乙淋洗WCX柱,弃去上述滤液。用1 mr-甲酸甲醇游浓(5-6)洗脱,洗脱流速约为1 mL/min,收集洗脱液，在40℃氮气吹+，用1.0mL中醇落液（5.10)定容，充分报荡溶解残渣，用0.45μm滤膜过滤，待测。7.3测定
7. 3. 1 色谱条件
色谱柱：Ci:柱100×2.1mm(内径),5μm;耗温：25℃；
进样量:25 μL;
梯度欲脱，洗脱程序参贴术录A表A.1。质谱条件
离子源：电喷雾源(ESI)，正离子；扫描方式：选择反应监测（SRM)；SN/T 1974—2007
e）雾化气、气帘气、碰撞气均为高纯氮气或其他高纯气体；使用前应调节各气体流盘以使质谱灵敏度达到检测要求;条件参见射录 B表 B. 1;d）喷雾电压、去集簇电玉、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度。7.3.3色谱测定
根据试样中被测物的含量情说，选取响应值适宜的标雅工作液进行色谱分析，标准工作被应有五个浓度水平，应包括零点。标难工作液利待测样液中亚中基蓝的响应均应在仪器线性响应范围内。上述色谱条件下，亚甲基蓝药物的保留时间为4,6 min,母离了和了离了参见附录B装B.2。标准品总离子流图参见附录 C图 C, 1。
7.3.4定性测定
进行样品测定时，如果检出的质量色谱峰保留时间与标推样品一致，非且在扭除背景后的样品谱图中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下得到的标准溶液谱图相比，最大允诈相对偏差不超过表1中规定的范印，则可判断样品存在对应的被测物。表1
相对离子丰度/%
充许的相对偏差/%
7.3.5空白实验
定性确证时相对离子丰度的最大充许相对偏差些
除不称取样品外，坞按上述测定紧件和步骤迟行8结果计算和表述
用数据处理软件中的外标去，或绘制标准曲线，按式（1）计算战+
式中：
>10 -20
羊中亚甲基益药物的残留量：
（1）
X试样中亚甲基蔬药物线运，单位寿毫克每千克（mgg）：V-.-样品最终定容体积单位步紊升(I)一由标推出线而得的美液中证用基蓝药物的含最，单位为微克每（以g/L）由标推油线而得的出实验中甲基监药物的含趾，单按为微克每升(ug/l)：Cn
试样量，单位为克
9测定低限与回收率
9. 1测定低限
本方法的测定低限为：0,005 tg/kg9.2回收率
在添加滋度为0. 005 mg/kg时,间收率为 71.0%~～100. 4%；在添加浓度为0.010mg/kg时，回收率为77.4%-~96.8%；：在添加浓度为0.040mg/kg时，回收率为75.2%~-102.0%第二法高效液相色谱法
10方法提要
试样中的残留物用乙膊-乙酸钠缓冲溶液提取后，液液分配到二氯甲烷层，中性氛化铅和阳离子固相萃取小柱净化，用配有紫外·可见检测器的高效液相色仪检测，外标法定最。3
SN/T 1974—2007
11 试剂和材料
同第5章。
12仪器和设备
12.1高效液相色谱仪，配有紫外-可见光检浏器。12.2其余同第6章。
13测定步骤
13.1提取
同7. 1。
13.2净化
同7.2。
13.3测定
液相色谱条件
色谱柱:Cls柱 50×2. 1 mm(内径),5 μm柱温：25℃
梯度洗脱，洗脱程序参见附录A表A.2；检测波长：655nm
进样量：50#L。
色谱剐定
根据试样中被测物的含量情记，选取响应值适宜的标准工作液选行色谱分析，标准工作接应有工个浓度水平，应包括冬点。标准工作滋和待测样液中亚甲基监的响应值均应在仪器线性响应范国内。在上述色谱条件下，亚甲基蓝的保留时间约为7.2 min，标准品色谱参见附录C中图C.2。13, 4空白实验
除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。14结果计算和表述
[同第 8 。
15 测定低限、回收率
15.1浏定低限
本方法的测定低限为:n,005 n/kg。15.2回收率
在添加浓度为0.005mg/kg时，问收率为74.2%~100.0%：在涨加浓度为0.010mg/kg时，回收率为73.0%～104.7兴；在添加浓度为0.040mg/k时回收率为77.8%-108.3%，时闻/min
R间/unin
15, 00
附录A
（资料性附录）
液相色谱-质谱/质谱法与离效液相色谱法梯度洗脱条件表 A. 1液相色谱-质谱/质谱法梯度洗脱程序流速/(μL/min)
甲醇/%
液相色谱法梯度洗脱程序
逆迷/(L/ni)
印醇/9
SN/T 1974—2007
.甲酸/%
0.1%甲酸/死
SN/T 1974—2007
离了校式
源温度
气帘气
辑助气
碰撞气
喷军电压
数据采束参数
中文名称
亚甲基
为盐离子。
附录B
（资料性附录）
液相色谱-质谱/质谱法器参数与监测离子表B.1
质谱参数
ESI,正离了
350℃
1=P:20,Q3=0.70
选择离子及保置时间
丹离子/z3
子离子（tm/)
碰撞能盘（eV）
附录C
（资料性附录）
液相色谱-质谱/质谱法与液相色谱法标准品谱图Rr:4. 63
d -mmpmmmmr mpmmm
60 000-
20 00-
亚甲蒸蓝标准品液相色谱-质/质谱图T:7.2
1/minn
图 C. 2亚甲基蓝标准品液相色谱图SN/T 1974—2007
SN/T1974--2007
Foreword
Annex A, annex B and annex C of this standard are informative annex.This standard was praposed by and was under the charge of the Certification and AccreditationAdministration of the People's Republic of China.This standard was drafted by Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of the People'sRepublic of China, Fujian Entry-Exit nspection and Quarantine Bureau of the People's Republic ofChina, Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of the People's Republic of ChinaThe standard was mainly drafted by Wu Bin, Xu Jinzhong, Chen Huilan, Yang Fang, Ding Tao, LinHong, Gu Dehua, Huang Juan.
This standard is a professional standard for entry-exit inspection and quarantine promulgated for thefirst time.
Note: This English version,a translation from the Chiness text.is onty far reference.8
SN/T 1974—2007
Determination of methylene blue residues in aquaticproduct for import and export---HPLCandLC-MS/MSmethod
The standard specifies the method of determination of methylene blua in aquatic product by Lc-Ms/MS and HPLC.
The method is applicable to eel and shrimp products. Methylene blue is detectable by this method.2 Normative references
The following normative documents contain provisions which, through feference in this text,consti.tute provisions of this standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of.any of thesa publications do not apply. However parties to agreements based on this standard areencouraged to investigate the possibility of applying the most recent editians of the normative docu-ments indicated below. For undated references, the latest edirion of the normative document re.ferred to applies.
GB/T 6682 Water for analytical laboratory use-Specification and test methods3 ample preparation and storage3.1 Sample preparation
For eel samples, which is combined the muscle tissues and skins heated by microwave oven andmixed well by homogenizer. Far eel products, which is combined al the edible portion and mixedwell by homogenizer, then sealed in clean containers and marked.For shrimp sampies, which is combined the edible portions and mixed well by homogenizer, thensealed in clean containers and marked.Precaution measures should be taken to avoid contamination or the change of residues concentrationin samples.
SN/T 1974—2007
3.2 Sample storage
The test sample should be stored at temperature of below - 18'cThe first method Lc-Ms/Ms methodPrincipte
Extraction of the methyiene blue residues. with acetonitile-arnmania.gcetate first, and with dichlo-romethane secand, then concentration and dissolution, cleaned up by he neutral alumium oxide and catian-exchange cartridge. Determination and confirmation is made by means of liquid chromatogra-phy-tandem mass spectrometry.5 Reagents and Materials
All reagents shall be of recognized arialytical quality uniess specified,prescribed by GB/T 6682,
5. 1 Formic acld: HPLC grade.5, 2 Methanol: HPLC grade.
Acetonitrife.
5, 4Dichloromethane.
Neutral alumium oxide (80 me10% formic acid sotution.
5.7 20% Diglycol solution.
100mesh
water\ is the first grade water5,a 0. 1 mol/L Sodium acetate buffer: Add 8. 2 g of sodium acetate into ca t oo0 mL of water,adjust pH to 4. s with acetic acid.5.91.0mol/Lp-toluenesulfonicacid5. 1o 30% methanol solution ( v/).5.11
Catian exchange cartridge: Wcx, 60 mg/3 mL.
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。